畜间布鲁氏菌病的血清学检测方法

白 翠，马晓媛，王 楠，曹东阳，胡泽宇，李海燕，郑 聪，刁鹏翔

1.吉林省动物疫病预防控制中心，吉林长春 130062；2.吉林省通化市二道江区畜牧兽医总站，吉林通化 134000；3.吉林省吉林市龙潭区江北乡畜牧兽医站，吉林吉林市 132000；4.吉林省吉林市昌邑区两家子乡畜牧兽医站，吉林吉林市 132000

布鲁氏菌病（简称布病）是由布鲁氏菌引起的人畜共患的传染、变态反应性疾病。病原体可以通过体表皮肤黏膜、呼吸道、消化道进入机体。人感染布病主要是与职业、饮食和生活习惯有关。

由于布鲁氏菌感染一周后可出现特异性血清抗体，因此，国内外均用血清学试验检测该病。方法主要有虎红平板凝集、试管凝集试验、胶体金免疫层析试验和酶联免疫吸附试验。

1 虎红平板凝集试验

虎红平板凝集试验操作简单，价格便宜，但有时会产生假阳性和假阴性，适合大量样品的初筛。

1.1 材料准备

1.1.1 虎红平板凝集抗原、标准的阳性和阴性血清，按说明书使用。

1.1.2 被检血清应新鲜，无明显蛋白凝块，无溶血和无腐败气味。

1.1.3 洁净的玻璃板，其上划分成4 cm2的方格。

1.2 操作方法

1.2.1 试验前，将血清和抗原在室温恢复30 min。

1.2.2 在玻璃板上加入25 µL 的被检血清。

1.2.3 被检血清旁加入等量的抗原。

1.2.4 用牙签类小棒混合均匀，在4 min 内观察结果。

1.3 结果判定

1.3.1 在阴阳对照成立的条件下，试验成立。

1.3.2 被检血清在4 min 内出现肉眼可见凝集现象，为阳性（+）， 无凝集现象，呈均匀粉红为阴性（-）。

2 试管凝集试验

操作时间比虎红凝集试验长，比较繁琐，但特异性较好，实用性也比较强，多用于复核。

2.1 操作过程

2.1.1 血清的稀释

牛、马、骆驼一般从1:50 开始，稀释4 个滴度；猪、狗和羊从1:25 开始稀释，同样是4 个稀释度。

2.1.2 抗原

将稀释好的抗原(按照抗原说明书稀释)加入到稀释好的血清管中，混匀，猪、羊或狗的血清稀释则依次变为1:25,1:50,1:100,1:200，牛、 马和骆驼的血清稀释度则依次变为1:50,1:100,1:200,1:400。

2.1.3 设置阴性、阳性对照。实验还要设置比浊管。

2.1.4 置37 ℃温箱24 h，取出检查并记录结果。

2.2 结果判定

牛、马、鹿和骆驼出现“++”以上凝集现象时，受检血清判定为阳性。猪、山羊、绵羊、狗出现“++”以上凝集现象时，受检血清判定为可疑反应；可疑反应家畜进行复检。

3 胶体金免疫层析试验

3.1 操作方法

用一次性滴管，缓慢吸取样品滴加1 滴于试剂圆孔中。然后滴加1 滴样品稀释液。

2 min 后肉眼观察结果。

3.2 结果判定

对照线（C线）处出现红线时试验成立，检测线（T线）处出现红线时即为阳性，否则为阴性。

4 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验有间接ELISA 抗体检测试验和竞争性ELISA 抗体检测试验。有试验证明，竞争性ELISA 比间接性ELISA 的敏感性稍高一些，本文主要介绍竞争性ELISA（c ELISA）方法。c ELISA检测敏感性和特异性好，用机器判定结果，避免了人为观察的干扰和误差，相比较其他方法结果更准确；但该试剂盒昂贵，检测成本高，不适用于基层大规模样品的检测，目前多适用于实验室大量的血清学检测以及珍贵动物的布病确诊。

c ELISA 是将布鲁氏杆菌抗原连接到ELISA 板上，样品中待检抗体和酶标抗体竞争性地与抗原结合，形成抗原抗体复合物。复合物中的酶标抗体与显色液发生反应，用分光光度计或酶标仪定量测定加样后的显色程度，显色程度越低，待检抗体的含量越高。具体的操作步骤详见试剂盒说明书。