响应曲面优化昆仑雪菊多酚提取工艺研究

周莉，赵乃玉，何元鹏，颜大林，董德峤，梁馨琳

(中南民族大学 药学院，武汉 430070)

昆仑雪菊(Coreopsistinctoria)，又名两色金鸡菊，盛产于我国新疆昆仑山脉海拔3000 m以上的高寒积雪地区[1].其作为中药具有清热解毒、治疗胃肠不适、治疗痢疾等功效[2]，并且含有黄酮类、酚类、苯丙素、甾醇类、聚乙炔类等多种活性成分，可以用于高效降低血糖血脂、抗菌消炎、抗氧化、降血压、细胞修复和抗癌[3-5].

昆仑雪菊提取物的活性研究已经成为一个热点话题，例如黄酮类化合物马里苷可以保护PC12细胞免受甲基乙二醛诱导的细胞凋亡[6]，保护人髓核细胞免受高糖诱导的损伤和细胞外基质降解，直接抑制肾脏SGLT2的表达来预防糖尿病肾病[7-8],除此以外，黄诺马苷通过靶向络氨酸激酶，有望成为糖尿病肾病的药物靶点[9]；2014年有人[10]用55%的乙醇提取多酚并评价其抗氧化能力，后续通过活性研究发现,多酚拥有预防心血管疾病[11]、脑衰老和急性肝损伤的保护作用[12-13].基于昆仑雪菊中多酚拥有如此重要功效，多酚的提取便成为亟待解决的问题.本研究将采用超声辅助响应曲面法提取昆仑雪菊多酚，以期得到最佳参数组合.

1 材料和方法

1.1 仪器与材料

昆仑雪菊，产自新疆和田阿克苏地区阿克苏市金石花园(尚士华果业).

无水乙醇(AR，GENERAL-REAGENT公司)没食子酸(99%，MACKLIN)；无水碳酸钠(分析纯AR，上海凌峰)；福林酚(BR，MACKLIN).

分析天平(ME204,瑞士 METTLER TOLEDO);超声波清洗机(SB-5200 DTD,宁波新芝);酶标仪(SPARK 10M,美国 TECAN);循环水式真空泵(巩义予华仪器).

1.2 昆仑雪菊多酚提取法

将罐装的干燥雪菊用粉碎机粉碎，过40～50目筛备用.称取适量的雪菊粉末加入一定体积分数的乙醇溶液，放入超声机中提取一段时间，抽滤得到提取液，定容至50 mL,测定多酚的含量，并按照(1)式计算多酚提取量：

(1)

式中：C是根据标准曲线计算出来的提取液中多酚质量浓度(μg/mL)；N为稀释倍数；M为雪菊的质量(g).多酚含量按照GB/T 8313—2018的步骤，采用福林酚比色法[14]进行测定，结果以每克昆仑雪菊的干物质中所含的没食子酸当量(mg GAE/g DW)表示.所有实验重复3次，采用GraphPad Prism8.0.1软件进行数据处理.

1.3 提取影响因素分析

1.3.1单因素试验方法

通过控制单一变量测试影响雪菊多酚提取因素.(1)乙醇体积分数对多酚提取量的影响：称取雪菊粉末12份，每份1 g，分别加入体积分数30%、40%、50%、60%的乙醇溶液40 mL，各3组；在35 ℃下超声提取15 min，抽滤收集提取液定容到50 mL，测定吸光度并计算多酚的提取量.(2)料液比对多酚提取量的分析：以40%的乙醇溶液作为提取溶剂，料液比(质量比体积,g∶mL)分别为1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70，其余条件同实验(1).(3)取时间对多酚提取量的影响：以体积分数为40%的乙醇溶液作为提取液，提取时间分别为20、30、40、50 min.其余条件同实验(1).

1.3.2 响应面实验方法

影响昆仑雪菊多酚提取量的因素很多，已有文献报道了超声功率、温度等因素的影响效果.本文重点关注乙醇浓度、提取时间和液固比对昆仑雪菊多酚提取量的影响,在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken响应曲面设计综合考虑乙醇浓度、提取时间和液固比对昆仑雪菊多酚提取量的影响，响应曲面试验设计因素与水平如表1所示.

表1 响应面试验因素与水平

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果与分析

2.1.1 提取溶剂乙醇浓度

由图1可知，多酚提取量随着乙醇浓度的升高，表现出先增后降的变化.乙醇浓度在30%～50%范围内，雪菊多酚提取量最多.多酚易溶于酒精，属于弱极性物质，乙醇的浓度和溶液的极性呈现负相关，增加前者的浓度会使得多酚更容易溶解于乙醇和水的复合体系中，但当乙醇浓度过高时，雪菊细胞中溶于液泡的多酚会随着蛋白质的变性而无法提取出来，加之溶液与多酚极性差异过大从而使得多酚的提取量降低.所以选择乙醇浓度40%做为最佳的提取剂浓度.

图1 乙醇浓度对多酚提取量的影响

2.1.2 料液比

多酚提取量随着料液比的增加而逐渐增大，后稳定波动趋于不变(图2).当溶剂达到60 mL时，多酚提取量达到最大值.随着溶剂的增加，雪菊粉末与溶剂充分接触，有利于多酚由内部向溶剂扩散，当达到60 mL之后，基本上多酚全部被提取出来.再增加溶剂时，多酚提取量基本保持不变.从生产成本角度考虑，当料液比为1 g：60 mL时所得到的提取量最好.

图2 料液比对多酚提取量的影响

2.1.3 提取时间

由图3可知，多酚提取量随着提取时间的增加而呈现先增加后降低的趋势.40 min时，多酚提取量达到最大.当时间过短时，多酚溶解的不够充分，随着时间的增长，多酚内外浓度差逐渐趋于平衡.当提取量达到最大时，时间继续增加,其他物质也会溶出，竞争限制了多酚的提取，同时由于多酚长时间暴露在空气中，发生氧化，从而使提取量降低.因此，选择40 min为最佳提取时间.

图3 时间对多酚提取量的影响

2.2 响应面试验优化结果

2.2.1 响应面设计与结果

表2为响应面实验设计及结果.

表2 响应面试验设计及结果

2.2.2 响应曲面模型建立及回归方程显著性结果分析

使用Design Expert软件分析表2实验数据，建立多元回归模型[5].拟合得到的多酚提取量(mg/g)与乙醇浓度(a)、提取时间(b)和溶剂体积与雪菊的质量比(c)之间的二次多项回归方程如下：

提取量=63.10+0.34a-0.72b+0.21c-1.83ab-0.060ac-2.03bc-3.14a2-2.64b2-2.95c2.

由表3可知，该模型的F=6.63，P=0.0104<0.05表明该模型的差异显著.R2为0.9614，说明该方程与对应的响应值吻合程度能够达到96.14%.此外，由F检验可知影响多酚提取量的主次因素为提取时间>乙醇浓度>溶剂体积与雪菊质量比.利用Design-Expert软件计算得出乙醇浓度54.2%，提取时间为54.7 min，液固比为42∶1(mL∶g)时多酚提取量最高.在此条件下，雪菊多酚提取量的最大预测值为61.429 mg/g.

表3 响应曲面二次模型的方差分析

2.2.3 响应曲面交互作用及结果分析

乙醇的浓度、提取时间和液固比3个因素对昆仑雪菊多酚提取效果的响应面图和等高线图见图4.

由图4可知，响应面图为先升后降的变化，乙醇浓度和提取时间、提取时间和液固比的等高线较为密布，可知这些因素之中的交互影响较明显，对雪菊多酚的提取有一定的重要作用.

图4 3因素对多酚浓度的交互影响

2.2.4 模型验证实验结果

将雪菊多酚的最佳提取条件调整为浓度54%的乙醇，料液比1 g：42 mL，时间55 min，这样的情况下采取超声波法进行提取实验，试验3次证明，所得的雪菊多酚提取量平均值为63.1 mg GAE/g DW.与预测值61.429 mg GAE/g DW差距不大，表明该结果是符合客观实际的.所以，采取响应面法优化昆仑雪菊多酚超声提取工艺合理可行.

3 结语

采用超声波法提取昆仑雪菊多酚，根据单因素试验结果，选择实验提取剂乙醇浓度、提取时间和液固比为主要的影响条件进行响应面优化试验，最后得到最好的工艺条件为乙醇浓度54%，料液比1 g：42 mL，时间55 min时.昆仑雪菊多酚的提取量是63.1 mg GAE/g DW，根据文献报道[15]，昆仑雪菊中总酚含量是83 mg GAE/g DW.因此有效成分的转移率是76%.该提取工艺该提取工艺具有较好的应用价值，此外，该方法具有设备简单、成本低、耗时少的特点，为昆仑雪菊有效成分的进一步研究提供了实验数据.