染色体微阵列技术对1例6p21微缺失综合征的产前诊断

万陕宁,党颖慧,郑芸芸,宋婷婷,张建芳,李 佳,杨 红

(空军军医大学第一附属医院妇产科,西安 710032;*通讯作者,E-mail:yanghonhfck@163.com)

6p21微缺失综合征也称颅骨锁骨发育不良综合征(cleidocranial dysplasia CCD;OMIM 119600)是一种罕见的常染色体显性遗传的骨骼发育不良综合征,主要临床特征是前额和顶叶突出、短头畸形、颅缝闭合较晚、发育不全或锁骨再生不全、多种牙齿异常和身材矮小等。染色体微阵列分析技术(chromosomal microarray-based analysis,CMA)可用于全基因组水平的拷贝数分析,不仅可以快速有效地检测常规核型分析的染色体不平衡变异,而且可以检测整个基因组的微缺失和微重复。与常规G显带核型分析相比,CMA具有高分辨率、高敏感性、快速准确、易于自动化等优点。本文报道1例联合应用常规G显带核型分析和CMA技术进行检测,发现6p21微缺失病例,并探讨其临床表现和发病机制。

1 病例资料

1.1 临床资料

孕妇,33岁,G3P1A1,孕26周,生育过一个健康孩子,人工流产一次。孕妇平素月经规则,孕期顺利,无特殊不适。无抽烟、嗜酒史,无胎儿畸形家族史。否认近亲结婚,否认辅助生殖。孕早期B超提示胎儿颈后透明层(NT)值1.6 mm,无创DNA检测结果为低风险。因孕中期B超提示胎儿颅骨欠规则,颅骨部分回声减弱,颅内脑回,脑沟减少,变浅,胎儿鼻骨显示不清,来本科室就诊。

1.2 检测方法

1.2.1 G显带核型分析 超声下进行羊膜腔穿刺术抽取孕妇羊水20 ml,取10 ml标本进行羊水细胞培养,按常规方法制片,G显带分析。显微镜下计数20个中期分裂相,分析5个细胞核型,对异常核型增加分析数,根据人类细胞遗传学国际(ISCN2016)命名体制描述染色体异常核型。

1.2.2 CMA检测 取10 ml羊水标本进行基因组DNA提取,使用QIAGEN公司生产的QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒,严格按照试剂盒说明书进行。应用美国Affymetrix公司生产的Affymetrix CytoScan 750k基因芯片进行CMA检测,实验过程包括酶切、连接、PCR扩增、片段化、标记、芯片杂交、洗染和扫描。使用Chromosome Analysis Suite(ChAS; version2.1)软件对芯片扫描的数据进行分析,参照数据库DECIPHER(http://decipher.sanger.ac.uk/)、OMIM(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)、DGV(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbvar/)、UCSC(http://genome.ucsc.edu)、PubMed(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)等进行结果分析。检测结果拷贝数变异CNV(Copy number variations)分为致病性CNV、可能致病CNV、临床意义不明CNV、可能良性CNV和良性CNV。

1.3 检测结果

染色G显带结果显示核型结果为46,XY(见图1),核型无明显异常。而CMA分析发现染色体6p21.1位置arr[hg19]6p21.1(44,032,138-45,486,795)x1发生1.45 Mb的缺失(见图2),查询数据库发现该区域为致病性CNV,该区域位置包含了19个OMIM基因(见图3),包括RUNX2(OMIM119600;600211),VEGFA(OMIM 192240),NFKBIE(OMIM 604548)等,其中绿色基因为致病基因。

2 讨论

颅骨锁骨发育不良综合征(cleidocranial dysplasia CCD;OMIM 119600)是一种罕见的骨骼疾病,属于常染色体显性遗传,具有特征性的临床表现。CCD是以颅面骨异常为主的全身各处骨骼系统广泛受累的先天性骨发育疾病[1,2],其特异的临床表现主要有:锁骨缺如,或发育不全,颅部囟门张开和延迟闭合,牙齿萌出异常或多生牙;全身其他临床特征还可表现为:面中部发育不足,圆锥状胸廓,肩胛骨小,骨盆发育不全,耻骨联合间隙增宽,身材矮小等。特殊临床表现还涉及脑异常包括回脑小,胼胝缺如,结构错乱以颞叶及小脑为著。胎儿期伴羊水过多等症状。

图3 染色体6p21区域包含的基因(绿色为明确致病基因)

本例患者羊水穿刺核型分析结果正常,CMA检测发现6p21位置发生1.45 Mb缺失,该区域包含19个OMIM基因,查阅数据库DECIPHER、OMIM、DGV、UCSC后,分析发现该片段区域功能性基因的缺失可导致患者出现6p21缺失综合征,即CCD。而孕妇孕中期B超提示颅骨欠规则,颅骨部分回声减弱,颅内脑回、脑沟减少,变浅等症状与文献报道[1,2]的CCD临床表现相似。

通过检索文献发现基因RUNX2是CCD的主要致病基因,位于6号染色体短臂6p21,为主要的调控转录因子,控制着前体细胞向成骨细胞的分化,是膜性和软骨内骨形成的关键[3]。它被称为骨骼发育的主基因[4]。在报道的CCD病例中,大约60%-70%的病例存在RUNX2突变,约13%的病例存在涉及RUNX2和相邻基因的微缺失[5],至少有62种RUNX2突变已经在CCD患者中被发现[6,7]。RUNX2基因是RUNX转录因子家族的一员,编码具有Runt结构域的核蛋白,该蛋白是成骨细胞分化和骨骼形态发生所必需的,并作为骨架基因表达所涉及的核酸和调控因子的支架。这种蛋白质既可以作为单体结合DNA,也可以作为异二聚体复合物的亚基结合DNA(亲和力更强)。编码蛋白的N端区域存在两个潜在的三核苷酸重复扩增区域,该基因中的这些和其他突变都与骨发育障碍有关。因此,CCD的特点是全身骨骼发育不良,尤其是异常的锁骨、未闭合的颅骨缝合线和骨间窝、多余的牙齿、矮小的身材以及其他各种骨骼变化。阿根廷的一份报告称,在对37例病例研究中,发现95%有颅骨异常,75%有单锁骨改变,100%有双侧锁骨改变[8]。

此外,6p21上除RUNX2以外的基因的单倍体不充分也可能是造成发育迟缓和伤口愈合不良的表型[9]。基因VEGFA(OMIM 192240),位于6p21,编码血管内皮生长因子A(VEGFA),它是血管内皮细胞的血管生成调节因子,VEGFA刺激上皮细胞的增殖、血管的形成和内皮细胞的存活。缺乏VEGFA可能导致血管生成不良和血管外重构,从而影响伤口愈合。基因NFKBIE(OMIM 604548),位于6p21,编码NF-kappa-B抑制剂,NFKBIE的缺乏可能导致感染和炎症的易感性,并导致伤口愈合不良[10]。因此,幼儿期的患儿由于骨化缺陷,头部外伤后易发生脑损伤,伤口愈合不良等情况,如有需要,可提供防护头盔,随时观察孩子的生长发育情况,进行相应的保护措施[11]。

综上所述,我们对1例孕中期B超提示异常的孕妇进行了产前诊断,胎儿的诊断结果为颅骨锁骨发育不良综合征,对本例孕妇夫妻双方进行CMA检测验证,发现胎儿的缺失为新发的,而且孕后期B超提示CCD症状明显,此家庭最终选择终止妊娠。我们对CCD的临床表现及发病机制进行了分析,为此类疾病的遗传咨询提供了依据,也有助于对症状轻微的胎儿出生后的表型进行初步估计,对于患儿及其后的治疗和随访有重要的意义。对于传统细胞遗传学检测方法而言,CMA是一个很好的完善和补充,尤其是针对染色体微缺失或微重复的产前诊断病例,染色体微阵列分析技术的优越性得到体现。对于临床表现特殊,常规G显带核型分析未见异常的患者,更应建议进一步的CMA检测。