p53的翻译后修饰及其与砷中毒致人体多器官损伤关系的研究进展

刘春燕，张爱华

(贵州医科大学公共卫生学院，环境污染与疾病监控教育部重点实验室，贵州 贵阳 550025)

p53 作为细胞生命活动中重要的监视基因之一，在细胞周期阻滞、DNA修复、氧化应激、自噬、衰老及凋亡等信号转导途径中具有重要的调控作用，p53 介导的信号转导途径与其翻译后修饰有着紧密联系。砷作为自然界中广泛存在的有毒类金属元素，人体长期暴露于砷污染的饮水、空气及食物所引起的砷中毒可致皮肤、肝、肾、肺等多器官损伤，因其健康损伤严重，加之致病机制不明和无特效治疗药物，成为制约砷中毒致人体多器官损伤防治的瓶颈，故研究砷毒性机制对寻找砷中毒致人体多器官损伤的治疗药物具有重要意义。近年来有关砷毒性机制的体内外研究表明，p53 突变、转录活性、稳定性、胞内定位等在砷毒性机制中具有重要的作用，而p53在砷毒性机制中发挥的调控作用与其受到泛素化、磷酸化、乙酰化、甲基化等多种翻译后修饰密切相关。因此，本文对p53的翻译后修饰及其与砷中毒致人体多器官损伤的关系进行综述，为进一步认识p53在砷中毒致人体多器官损伤中的作用和作为潜在治疗靶点的应用提供依据。

1 p53的修饰与功能

大量研究证实，p53 在响应多种胁迫应激反应中可表现出不同的功能，而p53 呈现功能的多样性与p53 受到泛素化、磷酸化、乙酰化、甲基化等多种翻译后修饰密切相关，这些修饰对p53稳定性、转录活性、胞内定位、突变等具有重要的调节作用。

1.1 泛素化修饰对p53功能的调节

泛素化修饰指一个或多个泛素分子在一系列泛素酶的作用下与底物蛋白共价结合的一种蛋白翻译后修饰过程，泛素化修饰后的底物蛋白可通过蛋白酶体等途径降解，该修饰是调控蛋白表达水平及活性的重要机制。鼠双微基因2(murine double minute，MDM2)是调控p53功能的一个重要E3泛素酶，研究显示，MDM2 通过直接结合p53 转录激活区并将其单泛素化或多泛素化致p53 失活是肿瘤恶性转化较典型的事件之一，50%～60%的癌症与p53 失活有关。应激信号通过激活p53 介导MDM2 表达增加，反过来，增加的MDM2 负调节p53 活性，使得细胞不至于因过高活性的p53 而引起损伤，然而，MDM2 对基础水平p53的维持有利于生理状态下细胞内稳态的平衡。除经典的p53-MDM2 反馈环外，含有RING-finger 结构域的E3 泛素样酶可与p53 相互作用并诱导其多泛素化，进而促进如胃癌、结直肠癌细胞增殖，然而，另有研究显示，泛素样酶MSL2(male-specific lethal-2)对p53 K351和K357的泛素化修饰并不影响其降解，但与胞浆定位密切相关。不同条件下，p53泛素化修饰的差异调节还有待进一步研究，其中常见的p53泛素化修饰位点如图1所示。

1.2 磷酸化修饰对p53功能的调节

图1 p53常见的翻译后修饰类型及修饰位点

磷酸化指由蛋白质激酶催化的把ATP的磷酸基转移到底物蛋白氨基酸残基或者在相关信号作用下结合GTP的过程，对蛋白活力具有重要的调节作用。磷酸化修饰作为研究较多的p53修饰类型与p53转录活性、稳定性、细胞器定位及构象等密切相关。p53 磷酸化位点横跨整个结构域，常见的磷酸化修饰位点如图1 所示，其中p53 丝氨酸(serine，Ser)是研究较多的磷酸化修饰类型，p53 Ser15、p53 Ser20(小鼠p53Ser18、p53Ser23)被共济失调毛细血管扩张突变(ataxia telangiectasia-mutated，ATM)激酶和检查点激酶1/2(checkpoint kinase 1/2，Chk1/2)磷酸化以保护p53 免受主要负调节因子MDM2 的降解，进而增强其稳定性和转录活性，这一机制在p53 Ser18 突变型小鼠的胸腺和脾细胞及p53 Ser23 突变型小鼠的胸腺细胞和发育的小脑中得到验证。酪氨酸激酶(tyrosine kinase，TK)引起的级联酶促反应介导的p53 Ser6、p53 Ser9 的磷酸化可致p53与转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)通路相互串扰，共同调节胚胎发育以及肿瘤发生过程中相关基因的表达。周期素依赖蛋白激酶5(cyclin dependent kinase 5，CDK5)对p53 Ser15、p53 Ser33、p53 Ser46 的磷酸化修饰通过增强p53 的转录活性和稳定性诱导神经细胞死亡。苏氨酸(threonine，Thr)155 的磷酸化修饰是Jun 激活区域连接蛋白1(c-Jun activation domain-binding protein1，Jab1)介导 p53 核输出的重要因素。目前，尽管DNA结合结构域中磷酸化修饰位点对p53 功能调节的研究有限，但有研究表明此区域是ChK1/ChK2等激酶的停泊位点，有助于p53 Ser20等其他位点的磷酸化修饰。p53 C 端(Ser315，Ser376，Ser392)磷酸化修饰的作用在于使p53 蛋白构象发生改变，以致p53 从“潜伏”状态转变为具备DNA结合能力的活性状态。

1.3 乙酰化修饰对p53功能的调节

乙酰化修饰指在酶(或非酶)的作用下将乙酰辅酶A 的乙酰基团转移至蛋白氨基酸残基上的过程，是一种可逆的蛋白翻译后修饰。乙酰化修饰通过改变赖氨酸残基上的电荷及蛋白构象，从而影响蛋白活性、DNA 结合亲和力和蛋白稳定性等。p53 有多个可发生乙酰化修饰的位点，其主要的乙酰化修饰位点如图1 所示。DNA 结合域和C 末端域的乙酰化修饰防止p53被泛素化降解，对增加p53 稳定性、促进p53 与靶基因结合增强其转录活性以及维持p53稳定性等功能具有重要作用。p53作为转录因子通常需一系列转录共激活因子或转录共抑制因子的协助参与调控下游靶基因的转录，p53 C端的乙酰化修饰通过招募转录共激活因子或转录共抑制因子是调控p53转录活性及下游靶基因表达的重要因素。体外研究发现，组蛋白赖氨酸甲基转移酶SET 作为p53 的转录共抑制因子，应激诱导p53 C端乙酰化水平的升高可显著抑制p53-SET的相互作用及SET在p53 下游靶基因启动子区的富集进而促进p53 转录活性，且p53 C 端的乙酰化修饰对p53-SET 相互作用的抑制在

p53

基因敲入小鼠模型中也得到验证，此体内外结果对开发针对该机制的药物研究具有重要意义。

1.4 甲基化修饰对p53功能的调节

甲基化修饰指从活性甲基化合物上将甲基经酶催化转移到其他化合物进而形成各种甲基化产物。蛋白质甲基化一般指精氨酸或赖氨酸在蛋白质序列中的甲基化，蛋白甲基化可调控蛋白-蛋白相互作用、蛋白-DNA或蛋白-RNA相互作用、蛋白稳定性、亚细胞定位或转录活性。研究表明，SET7/9 可诱导p53 K372甲基化修饰，此修饰可稳定p53并使其滞留在细胞核，参与调节p21 等靶基因的转录，然而，也有研究显示，SET8 对p53 K382 的单甲基化及组蛋白甲基转移酶SMYD2(SET and MYND domain containing 2)对p53 K370的甲基化可衰减p53与靶基因启动子的结合，从而抑制其转录活性，相反，赖氨酸乙酰转移酶PHF20(plant homeodomain finger 20)介导的p53 K370或K382 二甲基化可增强p53 稳定性和转录活性。除赖氨酸甲基化外，p53 上的精氨酸也可发生甲基化，蛋白精氨酸甲基转移酶 5(protein arginine methyltransferase 5，PRMT5)对 p53 及p53 结合蛋白的甲基化修饰参与调控p53 与靶基因的特异性结合。p53主要的甲基化修饰位点如图1所示。

1.5 修饰的串扰对p53功能的调节

如上所述，p53 有众多可被修饰的位点，这些位点的修饰可调节p53 稳定性、胞内定位及转录活性等功能。有趣的是，与p53 Ser18 或p53 Ser23 突变型小鼠的胸腺细胞、脾细胞相比，p53 Ser18 或p53 Ser23 突变型小鼠的胚胎成纤维细胞其p53依赖的细胞周期阻滞和p53稳定性并不受γ射线、电离辐射刺激的影响，此体内外结果的差异提示，在特定刺激或不同靶器官中，不可否认p53 Ser15、p53 Ser20(小鼠p53 Ser18、p53 Ser23)磷酸化修饰可增加p53稳定性，但对于体内p53稳定性的调控可能存在一个更为复杂而精细的作用网络，而不是靠单一的磷酸化修饰就可完成。p53 Ser15、p53 Thr18、p53 Ser120和p53 Ser137磷酸化的结合可通过招募CBP/p300增加p53的乙酰化修饰水平，进而增强其转录活性，相反，泛素样酶E4F1(E4 transcription factor 1)和赖氨酸乙酰转移酶PCAF(P300/CBP-associated factor)可竞争性结合p53 K320，且E4F1 对p53 K320 的泛素化可缓解PCAF 对K320 的乙酰化作用，进而阻断p53 的转录活性。N-乙酰转移酶10(N-acetyltransferase 10，NAT10)不仅乙酰化p53 K120 还泛素化p53 负调节因子MDM2，协同增强p53 稳定性，且p53 的乙酰化可阻断SET 对其甲基化的调控，另有研究发现，SET7/9 对p53 K372 的甲基化修饰导致其乙酰化水平增加对调节p53 稳定性和转录活性至关重要。这些研究表明，各位点可实现多种不同的修饰，各种修饰之间的交互作用可能是p53执行功能的决定性因素，可将这些串扰分为6 大类：同种修饰相互作用、邻近修饰相互作用、协同修饰相互作用、异种修饰相互作用、远端修饰相互作用、拮抗修饰相互作用。

2 p53 的翻译后修饰与砷中毒致人体多器官损伤的关系

p53 的表达及活性受到磷酸化、乙酰化、甲基化及泛素化等多种翻译后修饰的共同作用。近年来，国内外学者以细胞、动物实验为主，并充分结合有限的人群样本对有关p53翻译后修饰在砷中毒致人体多器官损伤中的作用进行研究后发现，砷中毒对p53 翻译后修饰的调节致p53 转录活性、细胞定位、稳定性的改变参与了砷中毒致人体多器官损伤进程，机制研究发现 ， 1 μmol/L NaAsO可 降 低 p53 Ser15、 p53 Ser46、 p53 Ser392磷酸化水平和p53 K382乙酰化水平，p53磷酸化及乙酰化修饰水平的降低通过削弱p53与DNA的结合能力并抑制下游靶基因的表达进而促使人角质形成细胞(HaCaT)恶性转化，另10 μmol/L NaAsO致人乳腺上皮细胞(MCF-10A)恶性转化与诱导MDM2 表达增加和p53 Ser15 磷酸化水平降低有关。p53的翻译后修饰除参与砷中毒致细胞恶性转化外，也可通过诱导细胞凋亡进而导致器官损伤，研究发现，砷中毒可通过增加大鼠肝组织中p53 Ser20 磷酸化水平及其介导的线粒体凋亡通路致肝细胞凋亡，体外研究显示，10 μmol/L NaAsO诱导人胚肺成纤维细胞(HELF)及HaCaT 细胞凋亡，其凋亡机制与促进p53核移位、增加p53稳定性和转录活性等功能有关，且最近的一项证据表明，高剂量砷不仅增加p53 热力学稳定和转录活性，甚至对发生结构型突变的p53仍能保持三级结构以及抑癌功能活性。尽管p53的翻译后修饰对p53功能的调节在砷中毒多器官损伤中的作用机制尚不完全清楚，但已发现砷对p53翻译后修饰的调控与p53 功能有着紧密联系，而p53 功能的变化决定了砷通过诱导细胞恶性转化导致机体癌变还是通过诱导细胞异常凋亡进而参与机体损伤。在燃煤型砷中毒患者皮肤损伤中发现，p53 阳性表达率与燃煤型砷中毒患者皮肤损伤的临床分级和病理分型相关，但也发现燃煤砷中毒可致人体外周血

p53

基因启动子区高甲基化、第5外显子低甲基化和突变。对来自西孟加拉邦高砷污染地区的162名角化病患者发现，砷中毒相关的器官损伤(周围神经病变、结膜炎和呼吸系统疾病)和遗传损伤与p53第72位精氨酸突变有关。这些研究从多层面揭示了p53在砷中毒多器官损伤中的作用复杂，结合体内外机制研究推测，这可能与p53 翻译后修饰的复杂性及不同砷浓度有关。

3 展 望

综上所述，p53 存在着多种翻译后修饰，其翻译后修饰的多样性、复杂性及可逆性决定了量化p53功能的困难性，研究者需要根据自己的研究背景，抽丝剥茧，分清主次，找出砷致机体损伤中p53的动态变化形式及占主导地位的修饰类型，为临床应用提供依据。另在砷毒性刺激下，p53 与其他信号转导途径有着怎样的交互联系？对其深入研究，将补充砷中毒致人体多器官损伤等复杂性疾病致病机制的进一步认识。鉴于p53翻译后修饰及介导p53功能的变化参与了砷中毒多器官损伤进程，因此，靶向p53相关修饰位点或修饰酶可能是预防和治疗砷中毒致多器官损伤的又一选择。在过去十几年里，尽管靶向MDM2-p53反馈环的小分子药物研发遭遇了挫折，但随着结合肽类、靶向降解剂以及mRNA疗法的不断发展，给p53-MDM2的药物研发带来新机遇，目前处于临床阶段的MDM2抑制剂如ALRN-6924、BI907282、Idasanutlin 等备受关注。近年来，国内外学者利用天然植物药进行砷中毒防治探索发现，刺梨制剂、银杏制剂、姜黄素等天然植物药对砷中毒引起的肝、肾、神经毒性及免疫失衡的保护作用与调节氧化应激、自噬、炎性反应等密切相关。鉴于这些信号与p53之间的紧密联系，探讨相应天然植物药对p53翻译后修饰及功能的调节对开发砷中毒多器官损伤治疗药物具有重要意义。