NIMA相关激酶2在胰腺癌中的表达及其临床意义

刘向梅，许达峰，王春玲，符于正，王丹，武金才

（海南省人民医院/海南医学院附属海南医院 肝胆胰外科，海南 海口 570000）

胰腺癌是消化系统常见的恶性肿瘤，在美国癌症病死率中排第四[1]。在我国，据2018年国家癌症中心发布的 2003—2013年居民癌症数据显示，胰腺癌发病率排第10位，病死率排第5位，其1年和5年生存率分别为26%和8%[2-5]。

由于其发病隐匿，多数患者在确诊时已处于晚期或转移，患者常在确诊后1年内死亡。手术仍是胰腺癌治疗的主要手段，但治疗效果并不佳。NIMA相关激酶2（NIMA-related kinases 2，NEK2）属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族，其主要功能是调控与细胞有丝分裂有关的纺锤体组装和中心体复制[6]。在食管鳞癌[7]、前列腺癌[8]、肝癌[9]、 口腔鳞状细胞癌[10]及肾癌[11]中NEK2高表达，且NEK2高表达与预后差及肿瘤进展相关。然而，尚无研究探讨NEK2在胰腺癌组织中的表达及与预后的关系。本研究旨通过免疫组化研究NEK2在人胰腺癌组织中的表达，并阐明其临床意义及与预后的关系。

1 资料与方法

1.1 组织标本收集

收集海南省人民医院肝胆胰外科于2013年 1月—2014年12月接受胰腺癌切除术的患者组织标本，共108例。胰腺导管腺癌有83例、黏液癌 22例，鳞癌3例；TNM分期I期15例、II期29例、III期64例。纳入标准：(1) 按照NCCN指南[12]患者均接受胰腺癌切除术，其中59例患者接受胰十二指肠切除术，49例患者接受胰体尾切除术，且病理确诊为胰腺癌；(2) 患者临床及随访资料齐全。剔除标准：患者存在其他部位肿瘤，且不能行手术治疗者。经手术切除下来的胰腺癌组织，均保存于科室研究室-80 ℃冰箱，并经石蜡包埋，经组织切片切成4 μm的组织切片待做免疫组化检测。该研究经医院伦理委员会批准同意实施。

1.2 病历收集及随访

对108例胰腺癌患者的性别、年龄、吸烟、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、肿瘤大小、肿瘤部位、糖类抗原199（carbohydrate antigen 199，CA19-9）、TNM分期、肿瘤分化程度、淋巴结转移等一般资料进行收集，术后随访每3个月随访1次，采用电话或门诊复诊的形式随访，随访内容包括患者生存及复发等。定义无瘤生存时间为胰腺癌术后至复发时间，定义总生存时间为胰腺癌术后至死亡时间，平均随访时间（55.3±6.7）个月，2020年1月为截止时间，6年为最长随访时间，108例患者共有4例失访, 失访病例在生存曲线上为截断值。

1.3 实验试剂

NEK2羊抗人单克隆抗体购自美国Abcam公司，兔抗羊二抗购自美国cell signaling Technology公司，两步法免疫组化试剂盒购自美国Invitrogen公司。

1.4 免疫组化和组化评分

对108 例石蜡组织标本切成约4 μm 厚的切片，按两步法行免疫组织化学染色，简要步骤如下：将组织切片在65 ℃烘片后，用二甲苯及酒精梯度脱蜡，采用3%双氧水室温灭活过氧化物酶15 min，柠檬酸钠行抗原修复，漂洗，3%胎牛血清蛋白封闭30 min后，加入NEK2羊抗人一抗（1:300），并在4 ℃下孵育过夜，漂洗3次，加入兔抗羊二抗（1:500），37 ℃下避光孵育2 h后加入显色剂，设立阳性及阴性对照，当浅黄色出现时终止染色，苏木素复染。免疫组化评分采用国际通用的评分规则，即总评分=染色强度评分+阳性细胞百分比评分，其中阳性细胞＜5%计0分；阳性细胞5%～35%计1分；阳性细胞36%～65%计 2分；阳性细胞＞66%计3分。不显色计0分；浅黄色计1分；棕黄色计2分；深褐色计3分。总分≥4分，为高表达组，共63例；总分＜4分，为低表达组，共45例。

1.5 统计学处理

统计软件采用SPSS 19.0版本，以例数（百分比）[n（%）]表示计数资料，NEK2表达与临床病理因素的关系采用χ2检验，无瘤生存率及总生存率的差异采用Kaplan-Meier曲线和Log-rank比较，影响预后的单因素及多因素分析采用Cox风险比例模型，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 NEK2 在正常胰腺及胰腺癌组织中的表达

在正常胰腺组织中NEK2不表达，在胰腺癌组织中NEK2染色定位于细胞膜、细胞质，在胰腺癌组织中NEK2高表达组有63例，占58.3%，NEK2低表达组有45例，占41.7%，NEK2在正常胰腺及胰腺癌组织中的典型组化图见图1。

图1 免疫组化检测NEK2 表达（×200） A：NEK2 在正常胰腺组织中呈阴性表达；B：NEK2 在胰腺癌组织中呈低表达；C：NEK2 在胰腺癌组织中呈高表达Figure 1 Immunohistochemical staining for NEK2 expression (×200) A: Negative NEK2 expression in normal pancreas tissue; B: Low NEK2 expression in pancreatic cancer tissue; C: High NEK2 expression in pancreatic cancer tissue

2.2 NEK2 的表达与胰腺癌临床病理因素的关系

NEK2表达与患者性别、年龄、吸烟、CEA、肿瘤大小、肿瘤部位无明显关系（均P＞0.05），而与CA19-9（P=0.015）、TNM分期（P=0.002）、肿瘤分化程度（P=0.034）、淋巴结转移（P=0.043）明显有关（表1）。

2.3 NEK2 的表达与胰腺癌预后的关系

NEK2高表达组1、3、5年无瘤生存率分别为60.5%、20.7%、5.2%，NEK2低表达组1、3、5年无瘤生存率分别为75.4%、50.6%、24.9%，NEK2 高表达组无瘤生存率低于NEK2 低表达组（P=0.000）。NEK2高表达组1、3、5年总生存率分别为75.6%、42.2%、15.3%，NEK2低表达组1、3、5年总生存率分别为85.7%、60.6%、30.1%，NEK2高表达组总生存率低于NEK2低表达组（P=0.000）（图2）。

2.4 影响胰腺癌无瘤生存率的危险因素分析

单因素分析示CA19-9、TNM分期、分化程度、淋巴结转移及NEK2高表达为影响无瘤生存率的危险因素，多因素分析示TNM分期（P=0.029）、淋巴结转移（P=0.016）及NEK2高表达（P=0.032）为影响无瘤生存率的危险因素（表2）。

2.5 影响胰腺癌总生存率的危险因素分析

单因素分析示TNM分期、分化程度、淋巴结转移及NEK2表达为影响总生存率的危险因素，多因素分析示TNM分期（P=0.035）、分化程度（P=0.042）、淋巴结转移（P=0.006）及NEK2高表达（P=0.000）为影响总生存率的危险因素 （表3）。

表1 NEK2 的表达与胰腺癌临床病理因素的关系[n（%）]Table 1 Relationship between NEK2 expression and clinicopathologic factors of pancreatic cancer [n (%)]

图2 不同NEK2 表达水平患者生存曲线 A：无瘤生存曲线；B：总生存曲线Figure 2 Survival curves of patients with different NEK2 expression levels A: Tumor-free survival curve; B: Overall survival curve

表2 影响胰腺癌患者无瘤生存率的危险因素分析Table 2 Analysis of risk factors influencing disease-free survival of pancreatic cancer patients

3 讨 论

胰腺癌病情进展快，恶性程度高，全球范围内发病呈逐渐增加趋势[13]，虽然手术可延长患者总生存时间，但仅20%的胰腺癌可手术切除，15%～20%的胰腺癌患者在确诊时就是晚期不可切除状态，总生存率较低[14-17]。尽管已经有以手术为主、放化疗为辅的胰腺癌综合治疗策略，由于缺乏可靠的早期标志物，且容易发生血管浸润转移，在确诊时多数患者处于晚期，胰腺癌患者中位生存期也仅6～12个月[18]。深入研究胰腺癌的发病机制对靶向药物的研发，提升胰腺癌的治疗水平极其重要。

遗传不稳定性是肿瘤发生的常见机制，一方面由于DNA损伤修复异常导致突变增加。另外，非整倍体和染色体不稳定是常见的现象，这种现象的产生常是由于细胞有丝分裂失控、纺锤体形成异常所致[6]。染色体有丝分裂调控失常是多种恶性肿瘤发生的中心环节。NEK2是中心体的一个核心组成原件，在细胞分裂周期中发挥关键作用。NEK2能够在有丝分裂的初始阶段对多种蛋白磷酸化，导致中心体的正确分离，另外还可调节中心体中微管的结构[19]。已有研究发现NEK2作为丝氨酸/苏氨酸激酶参与调控细胞周期，且可通过与多态性蛋白复合体异常结合，导致细胞通过细胞周期检验点异常，最终形成非整倍体细胞，进而引起细胞结构和功能基因异常表达[20]。在乳腺癌中，NEK2及cyclin D1的异常高表达可能与中心体扩增而导致的癌症发展有关[21]。

文献[22]报道在乳腺癌细胞系中敲除NEK2基因会导致癌细胞增殖、迁移和克隆形成被抑制，同时侵袭和迁移能力也有相应削弱，另外癌细胞的凋亡显著增加。在胰腺癌细胞系中也有类似的现象，敲除NEK2可抑制胰腺癌细胞侵袭和迁移[23]。在本研究中，通过免疫组化对108例胰腺癌组织的NEK2表达进行分析，发现NEK2在胰腺癌组织中表达高于正常胰腺组织，这提示NEK2可能在胰腺癌发生发展过程中发挥促癌作用。临床病理相关性分析发现，NEK2高表达与CA19-9、TNM分 期、肿瘤分化程度及淋巴结转移相关。进一步行生存分析发现，NEK2高表达组无瘤生存率及总生存率均低于NEK2低表达组，表明NEK2高表达提示胰腺癌患者术后预后不佳。具体的分子机制尚不清楚，已有研究发现在肝癌中，NEK2可通过激活PP1/Akt及Wnt信号途径促进肿瘤发展[24]。PAKT/NF-кB和MMP也可被NEK2激活而促进肝癌细胞转移[25]。在胰腺癌中，本研究推测NEK2的高表达可能通过影响染色质稳定性及非整倍体诱导，而导致胰腺癌细胞恶性增殖及转移。

在尤文氏瘤和非霍奇金淋巴瘤中发现， NEK2 mRNA表达水平与此类肿瘤表达密切相关[26]。而在滤疱性淋巴瘤恶化成侵袭性更高的弥漫性大B细胞淋巴瘤中，NEK2高表达与肿瘤恶性程度相关，伴随着患者存活期缩短，对化疗反应性也减弱[27]。在肾乳头状癌中，NEK2高表达的患者预后较差，NEK2高表达可作为影响肾乳头状癌预后的独立危险因子[28]。本研究发现，TNM分期、淋巴结转移及NEK2表达为影响无瘤生存率的危险因素，TNM分期、分化程度、淋巴结转移及NEK2表达为影响总生存率的危险因子，NEK2高表达与患者预后差相关。这些结果提示NEK2可作为胰腺癌术后患者预后判断的分子标志物。

综上，本研究发现NEK2在胰腺癌中高表达，NEK2高表达与胰腺癌恶性临床病理特征及预后差相关，NEK2高表达为影响胰腺癌术后患者预后的独立危险因素，可作为胰腺癌术后患者预后判断的指标。