脱细胞技术在组织工程血管中的应用进展

成 津 王 聪 谷涌泉

(首都医科大学宣武医院，北京 100053)

引言

随着生活水平的改善以及人口老龄化的不断发展，心血管疾病已成为致使人类死亡的首要原因[1]。截至目前，血管旁路移植术仍然是实现长期血运重建的最佳治疗措施。在此基础上，小口径(内径<6 mm)血管移植物在冠状动脉搭桥，下肢动脉旁路移植及血液透析中的动静脉造瘘等方面具有迫切的临床需求。自体动静脉仍然是血管替代物选择的金标准，但由于诸多原因，约1/3的患者无合适可用的自体血管[2]。另外，人造血管材料(膨体聚四氟乙烯等)作为小口径血管替代物的通畅率并不理想[3]。因此，寻求合适的小口径血管移植物成为临床工作中亟待解决的问题。

组织工程技术的出现和发展为解决上述难题开辟了新的途径。组织工程学是一门工程学、材料学和生命科学相结合的交叉学科，旨在体外构建具有生物活性的组织替代物，用于替代、修复或改善人体组织器官的形态和功能[4]。来源于天然组织的细胞外基质(extracellular matrix, ECM)成为最新兴起的一种组织工程支架材料，是指通过物理、化学、酶学等方法对天然组织进行脱细胞处理，去除组织内具有免疫原性的细胞成分，仅保留低免疫原性的细胞外3D基质骨架，用于异体或异种组织器官移植。因此，可使用脱细胞技术对异种或异体血管进行去细胞处理，以此构建适用于体内移植的脱细胞血管。脱细胞血管基质主要由胶原蛋白、弹性蛋白、糖胺聚糖以及其他多种生物活性因子构成。基质内的胶原蛋白和弹性蛋白保证了脱细胞血管的机械强度和柔韧性。胶原蛋白、糖胺聚糖和多种活性因子的共同作用有助于细胞的黏附和生长。基质支架内的网状空隙为细胞增值和基质沉积提供了充足空间。总之，脱细胞处理后的ECM支架保留了复杂的细胞外3D组织结构和生物活性，接近于原始血管的结构和功能，更加符合组织工程材料对血管移植物的要求，具有重要的应用价值。

1 脱细胞技术制备ECM的原理

供体细胞作为外来抗原，进入受体内部会诱发炎症反应和免疫介导的排斥反应。顾名思义，脱细胞技术就是通过多种方法去除血管组织中可引起免疫排斥反应的细胞和核酸，保留相对稳定的ECM，用于构建组织工程血管支架，使其植入体内后可被宿主接受，从而避免移植后的排斥反应。

脱细胞技术的最终目的是在尽可能彻底清除细胞的同时最大程度地保留原始血管的ECM结构成分，使最终获取的ECM支架具有接近天然血管的机械性能和生物活性，从而保证移植物在宿主体内的结构稳定和再生能力，以此来构建合格的组织工程血管移植物用于血管旁路移植手术[1]。

2 脱细胞方法

为了彻底去除组织内的细胞，研究人员尝试了不同的脱细胞方法，但是任何一种脱细胞处理都会对ECM造成不同程度的损伤。因此，为了获取满意的脱细胞血管支架，合理选择脱细胞方法至关重要。

2.1 物理方法

2.1.1冻融

反复冻融能够有效裂解组织或器官内的细胞。组织细胞经过冻融处理后在其胞内形成冰晶，致使剩余胞液盐浓度增高使细胞溶胀破碎。冻融对ECM的结构和力学性能影响甚微，组织经过反复冻融处理后对后续化学脱细胞作用更加敏感，可以显著提高脱细胞效率[5]。Daniel等[6]通过联合冻融和化学脱细胞方法成功制备出人源脱细胞脐静脉，并认为冻融的最佳温度为-80℃，温度偏高会导致效率低下，而液氮温度下冻融会导致纤维断裂。为了使血管组织内细胞充分裂解，可进行多次冻融循环[5]。反复冻融后，细胞内容物仍然存在，必须借助酶或化学处理才能彻底清除。

2.1.2压力法

细胞膜在高压力负荷下会出现变形破坏，机械压力可有效破坏血管内细胞，避免过多使用化学试剂引起支架内有毒物质残留，因此该方法被广泛应用。压力法主要作用于具有膜结构的细胞和细胞器，而对于ECM的影响微弱。 Funamoto等[7]使用高静水压(high hydrostatic pressurization, HHP)对猪的降主动脉进行脱细胞处理，得到的支架的力学性能较新鲜动脉并无显著差异，动物实验证实该ECM支架可在体内实现快速内皮化。Mahara等[8]使用HHP制备脱细胞血管支架，通过比较多个压力值和不同加压时间对细胞活性的影响，发现在200 MPa下加压10 min可使线粒体失活而致使细胞死亡。HHP联合化学试剂可高效去除血管内细胞，且不会显著破坏ECM支架的机械性能，得到的脱细胞血管在动物体内可保持通畅并成功内皮化[9]。

2.1.3机械搅拌和超声

机械搅拌往往贯穿于整个脱细胞过程。机械搅拌通常使用磁力搅拌托盘或者摇振器实现，机械搅拌有利于化学物质与组织充分接触并渗入组织内部，可以显著提高脱细胞效率，是常用的脱细胞辅助手段[10-11]。超声波可有效增强化学试剂对组织的渗透作用，同时能够减弱细胞膜的机械稳定性，可有效协助其他脱细胞方法对组织进行脱细胞处理[12]。Azhim等[13]使用超声波对猪降主动脉进行脱细胞处理，研究发现低频超声波可显著提升脱细胞效率，缩短脱细胞时间。对于脱细胞过程中的超声波输出功率等相关参数仍缺乏具体报道。

物理方法可显著提高脱细胞效率，对ECM的结构破坏较小而受到广泛青睐，但单独采用物理方法的脱细胞效果差，必须与其他脱细胞方法联合使用。

2.2 化学试剂

2.2.1低渗或高渗溶液

低渗或高渗溶液引起的渗透压改变可用于组织的脱细胞处理。高渗盐水可以从蛋白中解离出DNA。低渗溶液可以导致细胞胀溶，且对ECM结构破坏较小。Sakakibara等[14]通过单独使用高渗盐溶液(1 M NaCl)处理鼠的腹主动脉，得到的ECM支架回植入大鼠体内，移植后1周即可观察到新生的内皮细胞，5周后形成完整的内皮细胞层，1年后在ECM支架内部可监测到具有收缩活性的平滑肌细胞聚集，14个月后移植物仍保持通畅。Tondreau等[15]采用去离子水多次处理血管得到ECM，结果表明使用低渗溶液可达到良好的脱细胞效果，且不会影响ECM的结构和力学性能。为了强化渗透液脱细胞效果，研究人员将动物血管在高渗溶液和低渗溶液之间循环处理，以彻底去除残留细胞[16]。然而，为了更加高效地制备ECM，多数情况下需要将渗透溶液和其他化学方法联合使用[17]。

2.2.2酸和碱

酸碱溶液不但可以有效溶解胞质成分，而且能够清除核酸物质。Mangold等[18]用0.1%过氧乙酸对人脐静脉血管进行脱细胞处理，得到的ECM成分保留完好。Van等[19]将NaOH处理后的猪颈动脉植入大鼠体内，发现内皮细胞和平滑肌细胞在ECM支架内生长良好。此外，研究认为NaOH可以导致血管基质内胶原纤维断裂和降解[20]。由于酸碱溶液易引起蛋白变性而影响ECM的结构和功能，因此在血管组织的脱细胞过程中需谨慎使用。酸碱溶液常与去垢剂配合使用达到脱细胞目的[17, 21]。

2.2.3非离子去垢剂

Triton X-100是最常用的非离子去垢剂,通过破坏DNA-蛋白之间、脂质之间及脂质-蛋白质之间的相互连接而达到脱细胞目的，对蛋白质之间的作用影响较小。Triton X-100对疏松壁薄的组织可以起到满意的脱细胞效果，1% Triton X-100常用来制备脱细胞血管支架。Dahl等[22]比较了3种脱细胞方法对猪颈动脉的影响，结果显示单独使用Triton X-100并不能有效清除动脉内的核酸物质，脱细胞效果并不理想。笔者认为，Triton X-100作用相对温和，而该实验中各处理组脱细胞时间都不超过24 h，导致Triton X-100作用时间过短未能达到脱细胞目的。在此基础上，Zou等[23]将Triton X-100作用时间延长至48 h，使得到的脱细胞猪胸主动脉的基质结构和机械强度保留完好。Triton X-100对蛋白质作用较弱，因此对细胞外基质和蛋白类生物活性因子破坏较小，有利于细胞在基质支架表面黏附生长[24]。Triton X-100 脱细胞作用温和，现已较少单独用于脱细胞处理，常与酶和(或)离子去垢剂联合使用。Triton X-100毒性较强，残留在ECM内的Triton X-100容易导致细胞死亡，且会引发受体产生免疫反应，因此脱细胞处理后应充分清洗。

2.2.4离子去垢剂

离子去垢剂可以有效溶解细胞膜并能将DNA从蛋白中分离出来，但容易对ECM蛋白造成损害，常用的离子去垢剂主要有十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulphate，SDS)和脱氧胆酸钠 (sodium deoxycholate, SD)。Bertanha等[25]比较了2% SD和1% SDS对兔腔静脉的影响，结果发现SDS显著破坏了血管内胶原蛋白和显微结构。相比于其他去垢剂，SDS脱细胞效力较强，对于致密组织也能起到良好的脱细胞效果，但也更易引起ECM 蛋白变性，同时会导致糖胺聚糖及生长因子丢失[7]。在脱细胞血管的制备过程中，SDS的使用浓度从0.1%～1%不等，对于细胞的清除和ECM的损伤随使用浓度和脱细胞时间的增加而愈加显著。低浓度SDS可以有效清除静脉血管壁细胞，且不会显著破坏ECM[26]。通过对羊的颈动脉进行脱细胞处理发现，1%SDS会破坏ECM的机械性能，相比之下Triton X-100并无明显影响[27]。Tuan等[28]通过对比0.1%、0.5%、1%等3种不同浓度SDS对人脐动脉的影响，脱细胞处理48 h后发现1%SDS处理后的ECM内无核酸残留，然而脱细胞血管的GAG含量明显下降，脱细胞后的血管爆破强度显著降低。该结果表明高浓度SDS易损伤ECM。为了避免对细胞外成分的破坏，一些研究使用较低浓度SDS成功去除了动脉壁内细胞，得到性能良好的脱细胞动脉支架[29-30]。上述研究表明低浓度SDS对ECM影响较小，更合适用于血管的脱细胞处理。SDS对蛋白质亲和作用较强，可破坏部分蛋白类生物活性因子，影响脱细胞血管的生物活性。ECM中残留的SDS影响支架植入后受体细胞的增殖，但不会阻碍外源种植细胞的生长[31]。

2.2.5两性离子去垢剂

相比非离子去垢剂，两性离子去垢剂更易引起ECM蛋白变性。3-[3-(胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(3-[(cholamidoproyl)dimethy lammonia]-1-propanesulfonate, CHAPS)是最为常用的两性离子去垢剂。CHAPS的脱细胞效力介于Triton X-100与SDS之间，属于相对温和的脱细胞试剂。研究表明，内皮细胞在CHAPS处理后的脱细胞腹主动脉管腔面生长良好[32]。与此相反，Simsa等[24]通过对猪的腔静脉进行脱细胞处理发现，CHAPS显著降低了血管内GAG和可溶性蛋白含量，阻碍了内皮细胞在腔静脉表面生长。笔者认为这种差异可能是静脉血管壁组织薄弱，更易受脱细胞作用影响，导致ECM受损。随着脱细胞方法的不断改进，研究人员将CHAPS与SDS联合使用对血管进行脱细胞处理，处理后的ECM支架各结构成分保留完好，体内实验证实其良好的可再生活性[33]。

2.2.6醇类

醇类溶剂如丙三醇，可促使细胞脱水溶解而达到清除细胞的目的。醇类溶剂单独使用时效果较差，因此常与去垢剂或酶联用[34]。Van等[35]通过乙醇和丙酮的混合溶液去除人脐静脉内的细胞，与SDS相比，该方法得到的ECM支架可降低血小板在其表面聚集。McFetridge等[36]使用醇类试剂成功萃取出猪颈动脉血管内的甘油三脂，但处理后血管基质的力学性能受到影响。Uchimura等[37]使用乙二醇分别对大鼠和猪的动脉血管进行了脱细胞处理，结果显示乙二醇的脱细胞作用比Triton X-100更加高效，脱细胞血管的基膜结构保留完好，体外种植细胞后观察到细胞在脱细胞血管表面黏附生长。一些醇类，如甲醇、乙醇等易使蛋白沉淀，损害ECM的亚显微结构，使用时需格外小心。

2.2.7螯合剂

二价阳离子(钙、镁等)对于细胞在ECM蛋白上的接触黏附是必不可少的。螯合剂可分离位于其中心的金属离子，破坏细胞对ECM的黏附，从而将细胞从组织中分离出来，起到协助脱细胞的作用。常用的螯合剂主要有乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid, EDTA)及乙二醇四乙酸(ethylene glycol tetraacetic acid, EGTA)，前者更为常用。螯合剂单独使用并不能去除组织内的细胞，多与去垢剂或/和酶连用[38]。另一方面，EDTA可以抑制脱细胞过程中细胞破裂释放的内源性金属蛋白酶对ECM的破坏，从而在脱细胞过程中起到保护作用。

2.3 酶

2.3.1胰蛋白酶

胰蛋白酶(Trypsin)对水解赖氨酸和精氨酸的肽链具有特异性，37℃、pH=8条件下其活性最强。相比于其他脱细胞试剂，Trypsin更易引起ECM内蛋白变性，大量研究证明单独Trypsin脱细胞后的ECM受损严重。Zou等[23]使用0.5% Trypsin处理猪胸主动脉，脱细胞处理48 h后观察到ECM支架内的胶原纤维破坏严重。Yong等[39]使用0.25% Trypsin成功清除犬颈动脉细胞，得到的脱细胞支架与内皮细胞亲和性良好。Liu等[40]将胎猪的主动脉在0.1% Trypsin中作用36 h进行脱细胞处理，脱细胞前后血管的爆破强度和抗张强度无明显变化，内皮细胞在支架表面生长良好。这可能提示低浓度Trypsin更适合于血管的脱细胞处理。然而，对于管壁薄弱的冠状动脉来说，低浓度Trypsin仍会破坏ECM的结构成分[41]。研究人员通常将Trypsin与EDTA合用，以提高脱细胞效率。残留的Trypsin必须彻底清除，防止ECM进一步受损。

2.3.2核酸酶

核酸酶通过催化核酸和脱氧核糖核酸肽链的水解来破坏DNA和RNA。核酸内切酶促使DNA或RNA内部键的断裂，而核酸外切酶主要作用于DNA或RNA的末端键。因此，核酸内切酶对核苷酸的破坏最用更强。Mangold等[18]发现，相比于单纯去垢剂脱细胞，去垢剂联合核酸酶处理后的ECM成分和显微结构都受到严重破坏，力学性能下降，且不利于细胞生长。Simsa等[24]同样发现，核酸酶可能会破坏血管基质的力学稳定性并降低细胞糖胺多糖含量。然而，部分研究并未发现核酸酶在脱细胞过程中的负面效应[42-43]。到目前为止，核酸酶主要用于去除脱细胞后残留的核酸，关于其对ECM 的影响研究较少，有待进一步探索。残留在支架内的核酸酶可能会引发受体的免疫反应[44]。

2.4 血清

血清内的脱氧核糖核酸酶I可以将DNA消化成碎片，用于除去残留的DNA。Mg2+和酸性环境能够促进血清的脱细胞作用。脱细胞血管经过受体血清处理后得到的ECM纤维结构保留完好，而且能够避免在受体内发生严重的免疫反应[45]。因此有研究小组将血清用于制备脱细胞血管支架[46]。然而异种血清中的免疫原性物质会引起不良的宿主反应，限制了血清在脱细胞方面的应用。

3 总结与展望

脱细胞方案的选择常常需要联合上述多种方法，在尽可能清除细胞成分的同时保留ECM结构和功能完整，从而保证足够的机械强度和生物活性以利于脱细胞支架在体内发挥作用。尽管后期可通过交联、负载多种生物活性分子来改善脱细胞血管的整体性能，但是这些外来物质在体内长期作用的有效性和安全性并未被充分证实。目前研究者使用的脱细胞试剂和方法多种多样，但因为脱细胞材料的组织来源不同和对最终产品性能要求的差异，现有的脱细胞方案用于制备异种小口径组织工程血管的确切效果并未被广泛证实。制定高效合理的脱细胞标准方案仍需深入探索。

脱细胞血管的制备工艺简单，不受时间、技术和场所的限制，易于灭菌和消毒，加之异体或异种血管组织来源丰富，为脱细胞血管的大规模工业化生产和存储提供了可能，能够满足临床医疗耗材的需求。此外，脱细胞血管为生物植入物，必须达到不同国家对临床批准的严格监管要求。

脱细胞血管应具备良好的力学强度和顺应性，可承受缝线牵拉和血流冲击并有效预防吻合口内膜增生，避免形成动脉瘤，以符合临床应用对血管移植物的基本要求。Lindsey等[47]将脱细胞血管应用于下肢动脉硬化闭塞患者的血管旁路移植，取得了满意的通畅率和保肢率。尽管如此，对于组织工程血管的安全性和有效性仍需要对特定患者人群的多中心前瞻性临床研究来逐步证实。值得注意的是，由于血管组织来源长度受限，对于临床上需要进行长段血管移植的病例仍存在挑战。

随着组织工程技术的不断发展，脱细胞技术具有广阔的应用前景，尤其在构建小口径血管移植物方面具有独特优势。然而目前国内的相关技术并不成熟，因此需要多学科合作来共同推动国内组织工程领域向前发展，构建具有临床应用前景的血管替代物，为广大的心血管疾病患者送去福音。