中性粒细胞胞外诱捕网在真菌感染免疫中的研究进展

张晓辉 刘红芳 席丽艳,2,3

[1.南方医科大学皮肤病医院，广州 510091；2.中山大学孙逸仙纪念医院，广州 510120；3.广州市第一人民医院(华南理工大学附属第二医院)，广州 510013]

固有免疫是宿主抵御真菌感染的第一道防线，它主要是依靠免疫细胞(巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞和单核细胞等)对病原菌的吞噬和清除作用来抵抗病原菌的入侵。中性粒细胞作为一种重要的天然免疫细胞，是宿主抵抗致病微生物的第一道防线，通过吞噬或分泌细胞外细胞毒性物质、髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)的释放引发氧化杀伤，阻止入侵的真菌进一步的增殖、播散[1-3]。中性粒细胞除了吞噬清除病原体外，还可形成中性粒细胞胞外诱捕网 (neutrophil extracellular trap，NET)，这些纤维由染色质组成，这些染色质嵌有抗菌蛋白以捕获和杀死真菌这类难以吞噬的大型病原体[4]。NET自十余年前发现以来，一直是研究的热点，大量研究表明这种中性粒细胞功能与控制多种真菌感染有显著相关性。

1 NET的形成机制

NETs于2004年被发现[5]，最早的机制研究认为它的形成是一种新型细胞死亡途径，其形成过程是激活烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶和Raf/MEK/ERK通路使细胞核和细胞质内致密颗粒溶解，从而发生自噬，进一步生成活性氧(reactive oxygen species，ROS)，导致抗菌蛋白镶嵌在核染色质上，随后中性粒细胞将这些混合物释放到细胞外[6]。这一过程常持续数小时，并导致中性粒细胞死亡，又称为“NETosis”[7]，在此过程中通过NADPH氧化酶产生大量ROS是触发NET形成的关键因素，NETs结构中的MPO、组蛋白等抗菌蛋白捕获致病微生物后，可将其杀灭并降解，防止进一步扩散[6]。而后，Yousefi等[8]研究发现中性粒细胞NET的形成并不需要中性粒细胞的死亡，由活细胞形成的NET包含线粒体，但没有核DNA。这种NET的形成与ROS有关，可能是依赖NADPH氧化酶的。但当使用某些细菌(如金黄色葡萄球菌)刺激时，NET的释放可不依赖于ROS。研究中的中性粒细胞核DNA被包装成囊泡后与质膜融合，将其DNA释放到外部。整个过程非常独特和快速(5～60 min)[9]。近期研究显示，与酚溶性调节蛋白α(PSMα)相互作用后，嗜中性粒细胞也可以形成NET样结构。PSMα诱导的NETs包含典型的蛋白质标记，且能够捕获微生物。但与经典NETosis相反，PSMα触发的NET形成非常迅速，独立于ROS或MPO发生[10]，类似通过激活钙通道诱导NETs。在缺乏功能性NADPH氧化酶的情况下，连续的钙流入激活其相关的钾通道亦可诱发NETs[11]。由此可见，NETosis的触发及表现形式多种多样，这对于中性粒细胞的多功能性及抵抗各种病原体具有重要意义。

2 NET与念珠菌

2.1 白念珠菌

白念珠菌(C.albicans)的主要毒力之一是其可逆性从单芽发芽细胞转变为丝状菌丝的能力。研究表明它可诱导NET形成，其菌丝和酵母孢子的细胞外杀伤依赖于NET，20%～30%的白念珠菌杀灭是细胞外的[4,12]。Metzler等[13]在一些MPO完全缺乏的患者中观察到严重的微生物感染，尤其是念珠菌感染。在完全缺乏MPO的机体，中性粒细胞不能形成NETs，白念珠菌的生长也无法受到抑制，表明MPO是NET形成所必需的。NET的释放在控制微生物感染的同时，对局部组织亦有破坏作用，这与中性粒细胞蛋白酶[如弹性蛋白酶(NE)和蛋白酶3]的蛋白水解活性以及MPO的氧化特性有关。在真菌感染过程中，嗜中性粒细胞主要通过NET的脱粒或形成将NE释放到环境中。这个过程均受α1-蛋白酶抑制剂(A1PI)控制。使用天冬氨酸蛋白酶灭活A1PI，可影响NET依赖性的上皮和内皮细胞损伤，进而导致白念珠菌局部定植的增加[14]。Byrd等[15]研究细胞间基质(ECM)中的纤连蛋白(Fn)在NETs形成中的调节作用，发现人中性粒细胞识别纯化的白念珠菌β-葡聚糖后，将NET释放到Fn的作用很强。这种释放取决于补体受体3(CR3)对β-葡聚糖的识别，而不取决于Dectin-1或ROS，且需要Fn和细胞外调节蛋白激酶(ERK)信号。

近期研究还表明白念珠菌除了主要的细胞壁构建多糖(甘露聚糖和β-葡聚糖)以外，其分泌的天冬氨酸蛋白酶(Saps)也可以触发强度可变的NET，其中引起NET释放最有效的是由真菌菌丝分泌的Sap4和Sap6。这个过程涉及ROS依赖性和ROS非依赖性两种信号传导途径，主要通过与CD11b受体的相互作用实现。而中性粒细胞与细胞壁上的Sap9和Sap10接触后，则是利用CD16和CD18受体识别蛋白酶并依赖ROS作出反应。除了Saps外，作者还发现β-葡聚糖通过与Dectin-1以及CD11b和CD18受体结合触发ROS依赖的NET产生；而甘露聚糖被TLRs、CD14和Dectin-1受体识别后则主要通过ROS非依赖性途径触发NET释放[16]。此外，最新研究鉴定出Dectin-2亦可识别白念珠菌并介导NET的形成。Dectin-2激活下游Syk-Ca2+-PKCδ-蛋白精氨酸脱亚氨酶4(PAD4)信号通路，该信号通路可调节中性粒细胞NE、组蛋白瓜氨酸化和NETosis的核易位。这种NETosis是NADPH氧化酶非依赖性的，有助于抑制真菌的播散[17]。

2.2 其他念珠菌

耳念珠菌(C.auris)是一种新发现的真菌病原体，引起医院侵袭性念珠菌病暴发，目前对耳念珠菌的发病机理知之甚少[18-19]。Johnson等[20]发现嗜中性粒细胞不能有效杀死耳念珠菌，而耳念珠菌感染中也未发现NETs。近平滑念珠菌(C.parapsilosis)感染内皮细胞的研究中，作者发现嗜中性粒细胞会在内皮细胞表面巡逻，并杀死大多数黏附的真菌细胞，但对于内皮细胞内吞的近平滑念珠菌却没有杀伤作用，研究中亦检测不到NETs的形成，说明NETs的释放有赖于中性粒细胞与近平滑念珠菌的直接接触[21]。有趣的是缺乏纤丝能力的光滑念珠菌(C.glabrata)能通过吞噬作用依赖性途径引发NETs，其浮游及生物膜两种生长模式均可触发中性粒细胞释放NETs，但光滑念珠菌形成生物膜后，中性粒细胞针对其产生的ROS水平明显较低，所释放的NETs也明显少于对浮游形态细胞的反应[22]。

3 NET与曲霉

3.1 烟曲霉

曲霉菌是无处不在的环境真菌，免疫力受损的患者如吸入其孢子则可能发生侵袭性曲霉病并危及生命，其中烟曲霉(A.fumigatus)是最常见的病原体[23]。McCormick等[24]发现烟曲霉的分生孢子和胚芽管都能触发NET的形成，但中性粒细胞不会杀死胚芽管，而是降低其极性生长。这种抑制作用取决于NETs，且可以通过添加DNase-1降解NET来消除。Zn2+螯合钙卫蛋白也与烟曲霉菌诱导的NETs相关，主要机制是钙卫蛋白对锌的消耗。添加Zn2+即可消除NET介导的生长抑制。另一些研究也支持了NET不能直接杀灭烟曲霉的菌丝和孢子这一观点[25-26]。更进一步的研究显示针对烟曲霉感染的NET形成需要PAD4和CR3(CD11b/CD18)介导的ROS生成。PAD4是染色质缩聚的关键介质，用于催化组蛋白瓜氨酸化。但作者观察到角膜感染烟曲霉的C57BL/6和PAD4基因缺陷(Pad4-/-)小鼠在菌丝生长和角膜浑浊度方面没有差异，这说明在体外或感染的过程中，机体并不需要PAD4依赖的NETosis来控制菌丝生长或真菌感染[27]。

Alflen等[28]建立侵袭性肺曲霉病(invasive pulmonary aspergillosis,IPA)的小鼠模型，用瓜氨酸化组蛋白H3(citH3)的量来衡量NET的形成。研究发现PAD4-/-小鼠感染烟曲霉的分生孢子后，肺中的真菌负荷降低；与野生型对照相比，其急性肺损伤减轻，且TNF-α和citH3的浓度也较低。这些结果表明NETs的释放虽可限制真菌生长，但PAD4的存在也会降低IPA小鼠中烟曲霉的清除率，并导致急性肺损伤。在最新关于NET形成的信号通路研究中发现烟曲霉诱导的NET释放需要NADPH氧化酶2(NOX2)复合物产生活性氧，在下游中还需要CD11b/CD18、Src激酶家族、酪氨酸激酶Syk和IA级PI3激酶δ(磷脂酰肌醇3激酶)[29]。尽管Dectin-1与烟曲霉的免疫识别有关[30]，但对于烟曲霉诱导的NET释放却是可有可无的；而CD11b/CD18对于烟曲霉病的NET释放则至关重要，其中CD11b I结构域介导的识别是关键，研究中阻断其CD11b凝集素结构域并不影响烟曲霉诱导的NET释放[29]。

3.2 构巢曲霉

在患有慢性肉芽肿性疾病(chronic granulomatous disease,CGD)的患者中，构巢曲霉(A.nidulans)易发生侵袭性感染，是CGD患者死亡的主要原因[31]。CGD患者的NADPH氧化酶功能受损，导致嗜中性粒细胞的抗菌活性较差，无法产生NETs。通过基因治疗，CGD患者重建NET的形成可恢复机体中性粒细胞清除构巢曲霉分生孢子和菌丝的能力，使难治性侵袭性肺曲霉病快速治愈，证实了功能性NADPH氧化酶在NET形成中的作用和抗真菌活性[32]。作者进一步的研究表明基因治疗后CGD患者的NET恢复抗构巢曲霉防御能力具有钙蛋白依赖性；强调了钙卫蛋白(S100A8/A9)是NETs的关键抗真菌成分，亦具有抗构巢曲霉活性。通过螯合Zn2+，钙卫蛋白可抑制构巢曲霉的生长，并在较高浓度下可诱导不可逆的锌饥饿，结果证明钙卫蛋白在人先天抵抗曲霉菌感染的免疫防御中具有关键作用[24,33]。

3.3 黄曲霉

Kandhavelu等[34]对黄曲霉(A.flavus)引起的角膜炎患者眼泪中嗜中性粒细胞初级颗粒蛋白、核定位的组蛋白和其他NET特异性蛋白进行鉴定，发现患者眼泪中胞质蛋白和钙卫蛋白的水平增加了5倍，这表明NETosis可能在清除黄曲霉菌丝中发挥了作用，但关于其具体机制有待进一步研究。

4 NET与其他真菌

4.1 巴西副球菌

巴西副球菌(P.brasiliensis)引起的巴西芽生菌病是一种系统性真菌病，在大多数拉丁美洲国家特别是巴西流行。有研究已证实巴西副球菌的分生孢子和酵母形式可诱导人中性粒细胞产生NET[35-37]，且NET的形成可依赖或独立于ROS产生，而是否产生ROS与刺激中性粒细胞的真菌形态有关[37]。Dectin-1受体是巴西副球菌结合并诱导NETs释放的主要模式识别受体[37]。

值得一提的是，NETs对巴西副球菌是否有杀灭作用仍有待商榷。Mejia等[36]在实验中分别在人中性粒细胞与巴西副球菌(Pb60855菌株)的共培养体系中加入DPI、DNAse I或细胞松弛素D处理。当比较不同组之间的菌落形成单位(CFU)数时，没有发现显著差异，因而得出NETs对巴西副球菌没有杀灭作用的结论。但Bachiega等[37]使用巴西副球菌强毒力株(Pb18菌株)进行研究却发现加入DNAse共培养会显著抑制中性粒细胞的杀菌活性，显示了NETs对巴西副球菌的杀灭作用；说明人中性粒细胞杀死巴西副球菌既依赖吞噬作用又依赖于NET的细胞外机制。由于已发表的研究成果有限，尚不明确为何两个研究结论截然相反，可能与使用不同的菌株进行研究有关，也可能存在其他机制，仍待后续研究探讨。

4.2 新生隐球菌

这种致病菌以酵母菌的形式在宿主中传播，主要感染肺部和中枢神经系统[38]。研究证实NET对新生隐球菌(C.neoformans)有杀灭作用，尽管新生隐球菌和荚膜成分GXM可抑制人类嗜中性粒细胞中NET的产生，是一种潜在的新的重要调控因子。中性粒细胞NE、MPO、胶原酶和组蛋白是诱导NET杀菌活性的关键成分，其相关的信号传导途径取决于ROS和PAD4[39]。另格特隐球菌(C.gattii)亦可诱导中性粒细胞释放NETs，但它可形成细胞外纤维结构，这种结构增强了其对中性粒细胞杀伤的抵抗力[40]。

4.3 疣状毛癣菌

国内张秀军等[41]率先在疣状毛癣菌(T.verucosum)感染患者中研究了NET的抗感染作用。研究发现小鼠组织中可见明显的NETs结构，体外实验亦证实NETs对疣状毛癣菌有杀灭作用。

5 结 语

综上所述，研究表明NET具有多种刺激因子、信号传导途径及释放机制。鉴于报道的多样性，NETs释放不再只是杀菌，而是有更多样化的功能，如诱捕真菌以防止其传播和阻止进一步感染。现有关于NET和真菌的免疫研究主要集中在念珠菌属和曲霉菌属，有少量关于巴西副球菌和隐球菌的报道，但在其他深部真菌病病原体如暗色真菌、孢子丝菌和马尔尼菲青霉(篮状)菌等的研究暂未见报道。随着研究的不断深入，在其他病原真菌开展NETs的进一步研究将补充其诱导条件、释放机制及其抑/杀菌作用的具体环境等。