微生物鉴定技术在无菌药品生产中的应用

＊王元红

（山东鲁抗医药股份有限公司 山东 272021）

现阶段，我国的药品安全问题已经成为了当下社会最为关注的话题之一。2006年的“欣弗事件”，让我国进入了持续数年的药品微生物污染的高发期，大众对于药品安全愈加重视，无菌药品生产行业对于微生物鉴定技术的要求也在逐年提升。无菌药品已经属于高风险药品生产领域，尤其是随着2010年出台的《药品生产质量管理规范》以及《中华人民共和国药典》的实施，极大的提升了对无菌药品生产的要求。目前，国内多数的无菌药品审查和企业已经具备了GMP对于无菌药品生产的条件，无论是在硬件还是软件方面都有极大的提升。但不可否认，在无菌药品生产中，有关微生物鉴定技术还是有待加强，也并未建立完善的管理体系。从根本来看，微生物对于药品的质量和安全至关重要，尤其是对于临床当中免疫力低下人群的影响更大。基于此，无菌药品生产的过程中，务必要加强对于微生物鉴定技术的应用，以此提升无菌药品的药效。

1.无菌药品生产行业中应用微生物坚定技术的作用分析

因许多方面都会对药品卫生检测产生影响，因此，在进行药品生产时，微生物检测结果的准确度就显得尤为重要，同时还必须对微生物检测的技术进行优化和提升。尤其是在近些年，我国因药品安全引发的事故屡见不鲜，针对无菌药品的微生物检测是其保障产品安全的重要途径，微生物鉴定技术的优化可以助力无菌药品安全，使其检测的结果也更具可靠性。如今，微生物检测技术已经成为了无菌药品的重要安全保障，同时也为无菌药品的生产奠定了良好的基础。

2.无菌药品生产领域主要应用的微生物鉴定技术分析

2010年出台的GMP（良好操作规范）对食品、药品等生产企业提出了更高的要求，尤其是无菌药品从其生产加工开始，一直到仓储运输，都要确保药品的安全卫生，微生物作为对无菌药品影响最重要的因素，从其药物原料、辅料到最终的无菌药品以及生产环境都要进行微生物鉴定。无菌药品的整个生产流程都务必要对微生物进行适当的控制，一旦微生物出现控制不当的情况，无菌药品的质量必然会受到影响，这一结果不仅会为生产无菌药品的企业带来巨大的经济损失，还会对群体的生命安全造成威胁。因此，我们对于微生物鉴别首先就要清楚微生物风险的识别和控制。

(1)在无菌药品生产中应用的PCR技术研究

PCR技术是指利用体外酶的催化作用促进对特异性DNA片段的合成，PCR技术采用扩增产物的方式，使得DNA数量骤增，以其从原有数量的基础上增长百倍，之后便利用荧光条进行检测，这种方式对微生物种类进行鉴定极为便捷，从实际的角度而言，在其检测工作的过程中，PCR技术极为成熟，具有超强的灵敏性。而从理论的角度来看，在进行细菌检测的过程中，细菌的拷贝基因可以通过PCR的技术进行检测，此后便可以增菌，增菌的时间是受到一定限制的，这样检测技术的应用，便可以在极大的程度上节省检测的时间。

(2)无菌药品生产应用的基因芯片技术

基因芯片是指采用当前先进的科学技术和微加工技术，对基因的寡核酸苷酸进行排序，其排序的载体是硅片等物质，最终要达成的结果是要形成高密度的排序形式，而这也被称之为信息检测芯片。

在无菌药品生产领域中，其主要的应用技术为两个，其一是基因芯片，即信息检测芯片。其二是微生物检测技术，主要采用荧光标记技术融合而成，微生物检测技术主要是通过基因探针、寡核苷酸点之间的杂交情况来进行分析，将这二者的杂交情况进行扫描，来了解荧光的分布情况，最终是要判断出，检测样品当中是否存在微生物这一问题。

基因芯片技术想要扩大其检测的范围，可以采用增长探针的方式以此达到目的。而探针技术的不断升级和优化，不仅可以扩大其检测的范围，还能提高芯片检测的效果。基因检测技术可以应用的领域十分广泛，而针对无菌样品生产的检测，甚至可以细化到对试验检测中的致病源进行全面的检测。和传统的基因检测技术相比，现阶段基因检测技术仍旧在不断的优化和升级，其自动化的程度也得到了大大的提升，而且在优化的过程中，基因检测技术的操作也不断简化，不再像传统基因检测技术那般复杂，其准确性也得到了提升。

(3)无菌药品生产中应用的基因探针技术

基因探针检测技术利用核苷酸序列对生物素等进行标记的特性，以此通过与生物特定基因结构进行结合，并将基因、蛋白质结构标记出来，以达到方便检测的目的。其原理并不复杂，主要是通过对荧光标记的核苷酸，采用分子杂交的方法，使得二者进行结合特定生物素并携带标记信号，再对这一标记信号进行检测。

通常情况下会针对同位素进行检测，但探针的标记特定性极为鲜明，同时还是提升微生物检测准确性的重要路径，除此之外，基因探针检测技术还能极大的提升检测的速度，但因在检测的过程中，已经被标记的同位素具有一定的污染性，所以当我们在进行基因探针检测时一定要做好防护措施，在检测的过程中，还要注意操作的规范性，避免随意处理检测废弃物而造成恶劣的影响。

(4)基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱的应用

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱，简称MALDITOFMS。简单来说MALDI-TOFMS是一项菌种鉴定技术，其鉴定主要基于微生物核糖体和外周蛋白特异性及保守性。菌体蛋白与基质结晶，想要进行离子化，需要先进行吸光，当离子化后，会形成不同的离子峰，主要原因在于真空电场的质荷比不同，在离子化后进行分离而形成了不同离子峰，最终的结果是形成了蛋白指纹图谱。

MALDI-TOFMS具有极快的检测速度，在一次的检测当中，可以进样96宗，大样本筛查可以使用384孔板，检测结果在3min之内就可以得出。而且其灵敏性也极高，可以识别0.1μL的菌液，针对不同的菌株进行鉴定优势也极为明显，尤其是苛养菌、厌氧菌等一类。再加上MALDI-TOFMS的准确率较高，可以达到95%以上。

但MALDI-TOFMS也并非在任何鉴定中具有优势，它也存在一定的局限性。尤其是对于丝状真菌的鉴定准确率并不高。究其原因，因丝状真菌的菌体破壁并不完全，想要将菌体蛋白提取出来具有较高的难度。而随着研究的不断推进，想要解决丝状真菌蛋白提取的问题，我们发现，SDB即沙氏葡萄糖液体培养基在进行旋转培养、使用研磨-超声裂解提取法提取之前进行处理可以很好地解决这一难题，最终鉴定的准确率得到了提升。个别时候，MALDI-TOFMS也会对菌体进行误判，较为常见是将志贺菌认为成大肠埃希菌，这两个菌体在遗传背景上具有较强的相似性，而且他们的DNA序列的相关性也极高，还具有相似的菌体蛋白特征峰。其数据库有关志贺菌属相关内容缺失，可以使用生理生化和血清学进行实验，并对其结果进行判断。

(5)16SrRNA基因测序的应用

16SrRNA为核糖体RNA的一个亚基，其存在于两个区，其一是保守区，主要反应亲缘关系，其二是可变区，体现的是生物物种间的特异性。而16SrRNA基因对微生物进行鉴定，主要是根据遗传物质和分子水平，这一鉴定技术获得了业内的极大认可。

16SrRNA的保守性有其优势的一面，但同时也呈现出一大弊端，那就是异种同源性。有些不同种的微生物的16SrRNA序列几近相同，而想要解决这一问题，可以通过16SrRNA/ITS基因序列分析来完成。而ITS即内部转录间隔区是位于rRNA基因之间的非功能性片段，而这一非功能性片段的进化压力并不大，其变异性较强，即便极为接近的菌种，也可以在ITS序列上呈现出一定的差异性。

针对亲缘接近的微生物鉴定，大部分采用的是16SrRNA/ITS基因测序方法，主要是因其在这一方面具有较强的优越性，再通过HTS即高通量测序技术，不仅可以对痕量菌低丰度物种进行检测，其检测的效率和准确定都极高。

(6)VITEK2Compact系统的应用

VITEK2Compact即全自动微生物鉴定系统，其基础是微生物的升华反应，同时与比色、比浊动态分析技术相结合，并对其进行自动化鉴定。当我们在使用VITEK2Compact时，需要挑取单个菌落，将其与一定浓度的菌悬液进行配置，再根据菌落形态和革兰氏染色结果，接种到对应的鉴定卡上，对其进行分析，最后要对鉴定卡内的各孔培养基的生长变化值进行读取，最终对菌株的种属进行最终的确定。

鉴定卡孔共计64个，适用范围广泛，即便是在同一时间也可进行多项生理生化试验，一般性的试验结果大概在6-8h获得，而酵母菌试验结果时间较长，大约在18h左右。从中也可看出，VITEK2Compact优势极为明显，不仅操作简单，耗费时间还相对较短。

因VITEK2Compact的主要判定依据，是菌种的生理生化特性，而因菌种的特殊性，其生长的情况对鉴定的结果具有一定的影响。菌种储存应该多加注意，尤其是在稳定和储存时间方面更应留心。因为一些菌种的保存时间越长，其鉴定结果的符合率越低，而保存时间较短，其坚定结果符合率越高，也就是说部分菌种鉴定结果符合率与其储存时间呈负相关。基于此，在对菌种进行鉴定时，最好是能够使用新鲜的菌种，以便保证其鉴定结果的符合率较高。除此之外，生化反应对于菌液浓度也有所要求，因此，在进行生化反应为基础的鉴定时，尽可能的将生长缓慢、培养困难的细菌刨除在外。

3.结语

总而言之，无菌药品的微生物检测对其产品质量起到了至关重要的影响。因此，我们需要对微生物坚定技术持续研发，不断将其升级换代，同时也要将其安全作用在无菌药品的生产流程中呈现出来，以确保无菌药品生产的效率和质量。