基于网络药理学对黄连抗结直肠癌作用机制的分析＊

王与菲，张海婧，吴练秋

（中国医学科学院&北京协和医学院药物研究所，天然药物活性物质与功能国家重点实验室 北京 100050）

黄连是一味古老的抗菌药物，主要功能为清热燥湿、泻火解毒。近年来黄连素药效逐渐被挖掘，并已西药化，其在治疗心律失常、降血糖、降血脂、抗血小板聚集[1]及抗肿瘤[2]方面有一定的疗效。作为传统中药，黄连也因具有治疗腹泻的作用而被广泛应用于临床[3-4]，有临床研究表明，黄连碱对降低结直肠腺瘤复发风险安全有效，可作为息肉切除术后化疗预防的一种选择[5]，它具有多成分、多靶点、多途径协同作用的药理学特点[6]。黄连及其有效成分小檗碱和黄连碱等已被证实具有一定的抗结直肠癌作用[7-10]，通过诱导结肠癌细胞G0/G1 期细胞周期阻滞而抑制细胞增殖[11]，同时可诱导多种肿瘤细胞凋亡，如结肠癌细胞[12]、卵巢癌细胞[13]等。

结直肠癌（Colorectal cancer，CRC）约占全世界每年诊断出的所有癌症和癌症相关死疾病的10%[14]。它是女性第二常见的癌症，男性第三常见的癌症。CRC发病率和死亡率在全球范围内呈上升趋势，特别是在经济发达国家发病率最高[15]，近年来我国结直肠癌的发病率和死亡率也逐年升高。结直肠癌属于常见的消化系统恶性肿瘤，其恶性程度高、进展快、长期生存率低[16]。考虑到该疾病晚期才出现症状以及传统的手术疗法使CRC 生存预后较差，因此，早期发现CRC 并发现治疗CRC 的新药物、提高结直肠癌的治疗效果，是目前中医药领域的重要研究课题。中医药对于结直肠癌的认识历史久远，在整体观念和辨证论治思想指导下能够参与结直肠癌的全程治疗[17]，对于控制病情进展、减轻癌症放化疗不良反应、提高患者生存质量等方面具有明显优势，能够在整体治疗过程中起到至关重要的作用[18-19]，中草药作为在中国临床常用的补充和替代疗法，能有效减少放疗、化疗带来的毒副作用，改善患者免疫功能，减少术后复发及转移[20]。

网络药理学利用网络拓扑结构分析及生物信息学方法来解释药物、靶点、信号通路与疾病之间的复杂关系，为研究中药复方作用机理及临床研究提供了新思路[21]。结直肠癌的病理机制复杂，单一基因突变或信号通路的改变无法全面解释结直肠癌的发生机制。基于网络药理学的“药物-靶点-疾病”相互作用网络，有助于系统揭示黄连通过多成分、多靶点、多途径抗结直肠癌的作用机制，本文将采用网络药理学分析方法探讨黄连抗结直肠癌的物质基础和作用机制，希冀为临床研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 黄连化合物成分筛选

基于中药系统药理学数据库（http://tcmspw.com/tcmsp.php）[22]和中医药整合药理学研究平台（http://www.tcmip.cn）[23]检索黄连的主要化学成分。同时通过PubMed 文献[24]分析，对黄连的活性成分进行补充，并利用PubChem 数据库对检索得到的化合物成分进行结构验证，获取化合物简化分子线性输入系统（Simplified Molecular Input Line Entry System，SMILES）结构式。

1.2 黄连抗结直肠癌化合物靶点预测

将检索得到的黄连中主要化合物的SMILES 导入SwissTargetPrediction 数据库（http://www.swisstargetprediction.ch）[25-26]进行反向分子对接，筛选Probability＞0.5 的可能靶点。同时以“colorectal cancer”为关键词，通 过GeneCards（http://www.genecards.org/）[27]和Open Targets（http://www.targetvalidation.org/）[28]数据库检索结直肠癌相关的疾病靶蛋白。将上述数据库获取的结直肠癌相关疾病靶点与SwissTargetPrediction 预测得到的黄连主要化合物潜在作用靶点取交集作为黄连治疗结直肠癌的潜在作用靶点进行机制探讨。

1.3 黄连抗结直肠癌“化合物-靶点”网络构建及分析

为明确黄连中各活性成分、靶点和疾病之间的关系，将筛选得到的共有靶点与活性化合物对应关系导入Cytoscape 3.8.1 软件[29]，构建“成分-靶点”网络图。采用Network Analyzer 工具进行拓扑分析，对黄连抗结直肠癌的“成分-靶点”网络的介度（Betweenness centrality，BC）、紧密度（Closeness centrality，CC）以及连接度（Degree）进行研究，遴选关键药效分子和核心靶点。

1.4 黄连抗结直肠癌靶点蛋白互作网络构建及分析

为进一步了解黄连治疗结直肠癌潜在作用靶点的功能和作用机制，将筛选得到的共有靶点导入SRTING 数据库（https://string-db.org）[30]，物种设定为“Homo sapiens”，对作用靶点进行蛋白互作分析。利用Cytoscape 3.8.1 软件构建蛋白-蛋白相互作用（Protein-protein interaction，PPI）网络并采用拓扑学分析各网络节点的介度、紧密度以及连接度，遴选黄连治疗结直肠癌的核心蛋白。

1.5 黄连抗结直肠癌靶点生物功能分析及通路分析

应用R 语言对黄连治疗结直肠癌的靶点进行GO（Gene Ontology）[31-32]分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）[33]信号通路富集分析，探究黄连治疗结直肠癌潜在靶点参与的生物学过程与涉及的信号通路。

2 结果

2.1 黄连化合物成分筛选及靶点预测

通过TCMSP数据库、TCMIP 数据库及PubChem 文献检索，得到黄连活性化合物成分62 种。应用SwissTargetPrediction 数据库获取黄连62 种活性成分对应靶点，对靶点进行查重、剔除无法获得基因名的蛋白，并与GeneCards 和Open Targets 检索得到的结直肠癌疾病相关靶点取交集，最终获得134 对“化合物-靶点”对应关系，共包含91个靶点。

2.2 黄连治疗结直肠癌“化合物-靶点”网络构建及分析

将134 个“化合物-靶点”对应关系导入Cytoscape 3.8.1软件，构建黄连活性成分治疗结直肠癌的“成分-靶点”网络图（图1）。绿色代表活性化合物，粉色代表药物活性成分与疾病相关靶点的共有靶点，134 条连线表示活性成分对共有靶点的作用。

图1 黄连抗结直肠癌化学成分-靶点网络

将“成分-靶点”网络进行拓扑分析。结果表明，黄酮醇类类（如槲皮素等）和生物碱类（如小檗碱等）作为关键药效分子可能在黄连治疗结直肠癌过程中发挥重要作用（表1）。

表1 黄连抗结直肠癌关键药效分子及拓扑参数（前10位）

取前10个靶点为核心靶点。结果显示，碳酸酐酶（CA12、CA2等）、多巴胺受体2（DRD2）、乙酰胆碱酯酶（ACHE）、溶质载体家族6 成员3（SLC6A3）、醛糖还原酶（AKR1B1）等靶点的拓扑参数较高，可能在黄连治疗结直肠癌的过程中发挥核心作用（表2）。

2.3 黄连抗结直肠癌靶点蛋白互作网络构建及分析

将共有靶点导入String数据库构建PPI网络图（图2）。拓扑分析结果显示，度值较高的靶点包括蛋白激酶B α（AKT1）、表皮生长因子受体（EGFR）、前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）、非受体酪氨酸激酶（SRC）、热休克蛋白AA1（HSP90AA1）、基质金属蛋白酶9（MMP9）、磷脂酰肌醇-3 激酶调节亚基1（PIK3R1）、基质金属蛋白酶2（MMP2）、血管内皮细胞生长因子2（KDR）和微管关联蛋白τ（MAPT）（表3）。

表2 黄连抗结直肠癌关键靶点拓扑分析（前10位）

图2 黄连作用靶点PPI网络图

表3 黄连抗结直肠癌蛋白互作网络拓扑分析（前10位）

2.4 黄连抗结直肠癌靶点生物功能分析

利用DAVID 数据库对黄连化合物作用靶点进行GO 生物过程富集分析，设置阈值P＜0.05。研究相关靶点的生物学过程（Biological Process，BP）、细胞组成（Cellular Component，CC）和 分 子 功 能（Molecular Function，MF），选取P值最小的前10 个条目作图（图3）。富集度较高的生物学过程主要涉及细胞对化学压力的反应、细胞对活性氧的反应、细胞对氧化应激的反应、蛋白激酶B 信号传导、蛋白质自身磷酸化、细胞对药物的反应。细胞组成中富集度较高的条目主要包括髓鞘、蛋白激酶复合物、转移酶复合物、突触前膜、管基底等离子体膜、小窝、细胞膜等。同时黄连抗结直肠癌的作用与碳酸脱水酶的活性、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性、蛋白质酪氨酸激酶活性、碳氧裂解酶的活性、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性、跨膜受体蛋白激酶活性等分子功能密切相关。

图3 黄连抗结直肠癌核心靶点GO功能富集分析

2.5 黄连抗结直肠癌靶点KEGG通路富集分析

对黄连化合物抗结直肠癌作用靶点进行KEGG通路富集分析，设置阈值P＜0.05。筛选出前30 条通路（图4）。排名靠前的主要包括PI3K-AKT信号通路、蛋白聚糖途径、Ras 信号通路、前列腺癌磷脂酶D 信号通路、Rap1 信号通路、ErbB 信号通路、HIF-1 信号通路、FoxO信号通路、血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）信号通路、花生四烯酸代谢途径等。

3 讨论

3.1 黄连治疗结直肠癌的有效成分分析

黄连（Coptis chinensis）为毛茛科植物黄连、三角叶黄连或云南黄连的干燥根茎。黄连始载于《神农本草经》，是我国传统名贵中药材之一，具有清热燥湿、泻火解毒、抗菌、抗炎等功效。随着医学技术的发展，对黄连的药理研究不断深入，发现其对多种癌症有一定疗效[6]。本研究通过对TCMSP和TCMIP数据库及文献检索得到黄连活性成分62种。应用SwissTargetPrediction数据库获取黄连62 种活性成分对应靶点，并与GeneCards 和Open Target 检索得到的结直肠癌疾病相关靶点取交集，最终得到黄连抗结直肠癌相关靶点91个，提示黄连可能主要通过上述靶点发挥抗结直肠癌的药理作用。

在获得黄连有效成分的基础上，构建黄连活性成分-结直肠癌靶点网络分析，通过拓扑分析发现黄酮醇类类（如槲皮素等）和生物碱类（如小檗碱等）作为关键药效分子可能在黄连治疗结直肠癌的过程中发挥重要作用。文献报道，黄连活性成分小檗碱能够抑制拓扑异构酶和细胞周期蛋白，活化丝氨酸蛋白酶，诱导细胞色素C释放，抑制环氧酶-2活性[34]，对恶性胶质瘤C6 细胞的体外增殖具有抑制作用[35]。槲皮素广泛存在于植物的花、叶和果实中，具有抗炎、抗氧化、抗血小板聚集、抗肿瘤、和免疫抑制等药理学活性[36]。槲皮素还能够诱导肿瘤细胞凋亡[37]，但对正常细胞无明显影响[38]。并且槲皮素能够抗致癌和促癌因子，抑制癌细胞增殖[37,39]。槲皮素还可以通过抗线粒体途径和激活Caspase 途径诱导人乳腺癌细胞凋亡，通过EGFR 介导，抑制乳腺肿瘤细胞中MMP9 的分泌而限制肿瘤细胞的侵袭[40]。另有研究表明，槲皮素能够下调AKT/mTOR/p70S6K 信号通路，进而抑制肿瘤细胞的生长和血管生成[41]。

图4 黄连抗结直肠癌核心靶点KEGG通路分析

3.2 黄连治疗结直肠癌的有效靶标

在获得共有靶点的基础上，进行PPI 分析发现，AKT1、EGFR、PTGS2、SRC、MMP9 等作为关键靶点可能在黄连治疗结直肠癌的过程中发挥重要作用。AKT也被称为蛋白激酶B（Protein kinase B，PKB），PI3K 是作用于生长因子信号通路的一种重要调节蛋白，刺激酪氨酸激酶生长因子受体可以激活PI3K，进而激活下游AKT。PI3K/AKT 信号通路与肿瘤细胞的生长、增殖、生存、凋亡、代谢以及肿瘤耐药和肿瘤免疫逃逸密切 相 关[42]。激 活PI3K 可 使 下 游AKT 在Ser473 和Thr308 磷酸化生成p-AKT。有研究表明，结直肠癌组织中PI3K 和AKT 的表达明显高于正常组织。p-AKT在结直肠癌中的表达水平明显高于腺瘤，且p-AKT 和结直肠癌的分期、术前血清癌胚抗原的水平明显相关[43]。另外，在肿瘤细胞中MMP9 能够破坏细胞膜屏障，导致细胞浸润、游走能力增强。肿瘤转移主要依靠其血管不断生成，在肿瘤组织中，高表达的MMP9参与血管的生成，使得肿瘤细胞更加容易转移到周围正常组织中，引起产生肿瘤的转移[44]。

碳酸酐酶（Carbonic anhydrases，CAs)是锌金属酶的一个大家族，它催化二氧化碳的可逆水化，维持pH的稳态[45]。缺氧和细胞外酸中毒是侵袭性实体肿瘤的病理生理特征，细胞内pH 的调节对于维持肿瘤细胞在该微环境中的代谢和增殖至关重要[46]。这表明CAs在许多类型的癌症中有重要作用。有文献表明，CA1在结直肠癌中表达降低[47]，核转录因子IC（Nuclear factor IC，NFIC）是CA1 的上游因子[47]，这意味着NFIC可以通过调控CA1 的功能在治疗结直肠癌中发挥作用。碳酸酐酶9（Carbonic anhydrases，CA9）是收到缺氧诱导因子（Hypoxia-inducing factor，HIF）调控最强烈的蛋白之一，参与了氢离子浓度指数（Hydrogen ion concentration，pH）的调控[48]。CA9-ko 在缺氧条件下显著抑制肿瘤细胞的生长。异种移植瘤实验显示CA9-ko 可以显著降低肿瘤的体积大小[49]。CA12 的显著诱导发生在Na+/H+交换泵（Na+/H+exchanger isoform-1，NHE1）/CA9-dko 肿瘤中，表明这是一种弥补pH 调节蛋白损失以维持生长的潜在手段。CA9 被认为是一种可诱导缺氧的蛋白，研究表明，CA9 的表达与结直肠癌的发生和侵袭有关，控制细胞内外的pH 值，导致不良预后。在结直肠癌中，CA2 的表达可能被抑制，而CA9 可能表达上调，并且CA9 在晚期结肠炎相关结肠 癌（Ulcerative colitis-associated colorectal cancer，UCCA）中表达显著升高[50]。

AKT1 基因的多态性会影响癌细胞的新辅助化疗的敏感性[51]，有研究显示，p53/miR-374b/AKT1 信号在人结肠癌细胞HCT116 的凋亡中发挥重要作用，可以应对博来霉素（Bleomycin，BLM）诱导的DNA 损伤[52]，这意味着调控这些因素可能提高结直肠癌细胞对化疗的敏感性。在结直肠癌患者体内，AKT1 的高表达水平与生存率显著相关[53]。敲除AKT1 可显著抑制结肠癌细胞迁移和侵袭，在体内外结肠癌中显著增加上皮钙粘蛋白（Epithelial cadherin，E-cadherin）表达，降低 神 经 钙 粘 蛋 白（Neural-cadherin，N-cadherin）、phospho(p)-AKT1、磷酸化糖原合酶激酶3β（Phosphoglycogen synthase kinase-3β，p-GSK-3β）和Snail 的表达。因此，AKT1 可能是结肠癌细胞的关键调控因子，也是该疾病的潜在治疗靶点[54]。

使用抗表皮生长因子受体（Anti-epidermal growth factor receptor，anti-EGFR）抗体治疗转移性结直肠癌（Metastatic colorectal cancer，mCRC）可以改善患者预后，特别是针对预测性生物标志物选择缺乏RAS 突变的患者[55]。治疗mCRC 患者唯一确定的生物标志物就是肿瘤RAS 突变状态，这是抗EGFR 治疗的阴性预测标志物[56]。西妥昔单抗和帕尼单抗都是针对EGFR 的胞外结构域的单克隆抗体，该结构域阻断配体结合并抑制下游RAS-RAF-MEK-ERK 信号通路，从而治疗野生型RAS转移型结直肠癌[57]。

PTGS2 产生炎症介质前列腺素E2（Prostaglandin E2，PGE2），并促进结直肠癌的发展。在结直肠癌患者中，PTGS2 表达可能会增加肿瘤复发风险，并且和较差的特异性结直肠癌生存期有关，但与总生存期无关[58]。

SRC 在超过80%的结直肠癌患者中异常过表达和激活，SNX10（Sorting nexin 10）在人结直肠癌组织中的显著下调，上调SNX10 的表达来调控SRC-STAT3和SRC-CTNNB1 信号通路的活性[59]。有文献表明，SRC 是Cten 信号通路中一个新的重要的功能靶点，Cten 蛋白在转录后稳定SRC 促进结直肠癌上皮间质转化和转移[60]。因此，SRC 可能成为未来发展的潜在治疗靶点。

3.3 黄连治疗结直肠癌的关键通路分析

GO分析及KEGG通路富集结果显示，共有靶点主要富集在PI3K-AKT 信号通路、蛋白聚糖途径、Ras 信号通路、前列腺癌磷脂酶D 信号通路、Rap1信号通路、ErbB 信 号 通 路、HIF-1 信 号 通 路、FoxO 信 号 通 路、VEGF信号通路、花生四烯酸代谢途径等多条通路中。

PI3K/AKT/mTOR 通路与结直肠癌发展密切相关，并且mTOR 通路成分在结直肠癌中过表达[61]。PI3K/Akt/mTOR 信号在结肠上皮细胞中发挥重要作用，它调节细胞对葡萄糖和各种氨基酸的反应，以及对各种细胞外信号的反应。研究证实Akt通过抑制不同亚型Akt1 和Akt2 在结肠癌中的作用，从而降低肿瘤的生长[62]。PI3K/mTOR通路的抑制剂已成功用于原发性和转移性结直肠癌的治疗，例如，南蛇藤醇通过PI3K/AKT 信号通路抑制MMP3 和MMP7，抑制结直肠癌细胞增殖和迁移[63]，有研究证实，在结肠癌的异种移植小鼠模型中，过表达二型肌苷单磷酸脱氢酶（Inosine monophosphate dehydrogenase type II，IMPDH2）可通过激活PI3K/AKT/mTOR 通路促进G1/S 期细胞周期转变，促进细胞侵袭、迁移和上皮-间充质转化（Epithelialmesenchymal transition，EMT），加速裸鼠异种移植瘤的生长，在结直肠癌细胞和组织中，IMPDH2 在mRNA 和蛋白水平均上调，与CRC 患者生存差显著相关[64]，使该通路成为临床癌症治疗的一个有前景的靶点。PI3K/AKT/mTOR 信号通路与结肠癌细胞的发生、转移、耐药和干细胞特性有关[65]，从而使该通路成为药物治疗的首选靶点。在各种临床前和临床模型中，各种天然和合成分子被证明可以抑制结肠癌，这些抑制剂作为临床抗癌药物的潜力。

基于典型突变的分类和最近的转录组的分类中普遍认为RAS 突变在结直肠癌的发病机制中起着核心作用[66]。有研究表明，在76%的原发性CRC 病变中发现RAS 突变[67]，RAS 可激活不同信号通路的下游效应器，主要激活PI3K-AKT 信号通路和级联组成RAF激酶，它激活促分裂原活化蛋白激酶1（Mitogenactivated protein kinase，MEK1）和MEK2，以及随后激活细胞外信号调控激酶1 和2（Extracellular signalregulated kinases，ERK1 和ERK2），促进细胞生存、增殖、入侵和迁移[68-69]。RAS 突变状态被用来预测转移性结直肠癌患者对抗表皮生长因子受体药物的耐药性[53]。大约40%的结肠直肠癌发生KRAS 突变，在结直肠细胞恶性转化的早期以及转移性结直肠癌的晚期都KRAS 突变都发挥了关键作用[70]，因此，RAS 被认为是诊断和预后人类恶性肿瘤的新的潜在生物标志物。

CRC 患者肿瘤中RAP1 表达较高，RAP1 参与代谢相关通路的调控，转录调控基因在细胞粘附和肿瘤进展中发挥作用[71]。与相邻正常组织相比，乳腺肿瘤组织中RAP1表达水平显著升高，提示RAP1可能在肿瘤进展中发挥作用[72]。数据分析还发现RAP1 的高表达与结直肠癌的预后不良有关[73]，但是在CRC 放疗耐药中的作用仍是未知的。Rap1 GTP 酶激活蛋白是Rap1活性的负调节因子，其下调与结直肠癌的预后不良有关，并可能影响肿瘤进展[74]。在结直肠癌病例中，Rap1GAP表达与MMP-9呈负相关，与E-cadherin呈正相关[75]。Rap1 可能参与CRC 的肿瘤进展，并可能成为结直肠癌患者预后预测的潜在靶点。

结直肠癌患者血清中VEGF、MMP-2 的表达与肿瘤浸润深度、Dukes 分期、结直肠癌肝转移（Colorectal liver metastasis，CLM）、淋巴结转移有关[76]。在多个结直肠癌细胞系中，细胞内VEGF 和VEGFR1 的缺失强烈抑制了结直肠癌细胞迁移和侵袭[77]。贝伐珠单抗（Bevacizumab/Avastin）是血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）的重组人源化单克隆抗体，2004年首次被食品和药物管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准作为治疗转移性结直肠癌的抗血管生成药物[78]。有研究表明，CRC 患者门静脉血清VEGF、MMP-2 水平可作为判断CRC 预后和预测CLM 的有效指标，VEGF、MMP-2 高表达的患者术后应积极行动脉化疗栓塞术（Transhepatic arterial chemoembolization，TACE）治疗[76]，以提高生存率。

4 结语

本研究通过网络药理学的方法，通过网络关系探析药物和疾病之间的作用关系，探究了黄连抗结直肠癌的物质基础和作用机制，黄连的结构与我们研究的新化合物844 结构类似，对课题进步一研究具有重要参考价值及指导意义。

综上所述，黄连中的黄酮醇类类和生物碱类等多成分，可通过多靶点、多通路协同发挥抗结直肠癌的作用与我们后期开展的实验研究结果相一致。CA1、CA12、CA2、CA9、AKT1、EGFR、PTGS2 和SRC 等可能是其核心治疗靶点，PI3K-AKT、Ras、Rap1 和VEGF 等可能是其主要作用通路。在临床实际应用中，黄连虽然被用于癌症治疗中，但往往仅作为随证加减辅助用药来提高患者的免疫水平，其治疗癌症的能力还有待不断挖掘探索。目前针对黄连治疗结直肠癌相关的基础研究较少，大多数研究的关注点在于黄连活性成分对癌疾病治疗的作用，但对其发挥抑癌的具体作用机制尚不明确，并且至今未有系统的网络药理学对黄连抗结直肠癌的有效靶标和相关信号通路进行深入研究分析。为更好应用中草药来治疗癌症，我们需要对黄连有效成分进行分析，对药物作用靶点以及药物是通过哪条信号通路在机体内发挥药效进行更深入的探究。因此，本文具有一定现实意义与创新性，但是对现有的数据库中进行分析挖掘，一定程度上也存在局限性，需要后期基础研究和临床研究进一步验证，同时希望通过后续试验验证，表明结果的准确性。