环状RNA与具核梭杆菌在结直肠癌进程中的研究进展

李君丽， 周鹏志

1.广州医科大学，广东 广州 511400；2.广州医科大学附属第三医院消化内科

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)起源于结直肠黏膜上皮，是消化系统常见的恶性肿瘤之一，每年可导致约90万人死亡，成为当今世界上第二大致命癌症，其致死率达9.2%，仅次于肺癌的18.4%[1]。因各个国家的癌症谱不同、早期癌症检出率较低及我国某些地域的治疗策略不达标，我国有着更高的癌症致死率，在2018年，我国CRC的发病率约12.2%，致死率达8.0%，且两者均呈上升趋势。此外，因人口增长和老龄化、生活方式西方化，未来几年内我国癌症负担总体上仍呈持续上升的趋势[2]。目前认为CRC与遗传、环境(如饮食)等多种致病因素有关，是基因-环境共同作用的结果，但其确切的病因与发病机制仍有待进一步探明。环状RNA(circular RNA，circRNA)是一类普遍存在于真核细胞中参与基因表达调控的闭合环状非编码RNA，比线性mRNA更稳定，其最主要作用是充当竞争性内源性RNA(ceRNA)/miRNA的海绵[3]。不同的circRNA可发挥致癌或抑癌作用，参与肿瘤的增殖、侵袭、转移、凋亡等生物学过程，与肺癌、膀胱癌、胃癌、肝癌、CRC等多种癌症密切相关[3]。而具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum，Fn)为口腔中的共生菌，可在CRC组织中富集，促进肠道肿瘤的形成[4]。近年来，miR-21被发现在CRC组织中异常表达，参与调控不同的靶基因和肿瘤的增殖、侵袭、转移、凋亡等过程，与CRC的进程显著相关，被公认为是CRC中重要的致癌基因[5]。深入研究发现，miR-21是Fn的下游靶点，Fn通过介导TLR4/MYD88信号通路持续激活NF-κB，后者与miR-21的启动子结合并增加其转录水平，进而促进小鼠CRC细胞的增殖和肿瘤的进展[6]。若CRC患者体内同时富集Fn和高表达miR-21，其预后不良的高风险也增加[6]。近期有研究试图以circRNA-miRNA-mRNA调控网络为导向探讨关于CRC诊治的新手段[7]。Yuan等[8]通过体内外试验发现，circ_0026344可充当miR-21的海绵来抑制CRC细胞的增殖和侵袭，同时促进细胞的凋亡。由此可见，对于富集Fn且高表达miR-21的CRC患者，circRNA可能是一种未来可期的治疗靶点。现对circRNA、Fn在CRC中的诊治和预后价值作一概述，以期对CRC的临床诊治提供新的思路。

1 CRC概述

在全球常见癌症中，CRC位居女性中的第二位、男性中的第三位，而男性的发病率和致死率均比女性高约25%[1, 9]。除了遗传因素、男性和人口老龄化外，肥胖、摄入高脂肪低纤维的膳食、缺乏体育锻炼、吸烟、饮酒、肠道菌群紊乱等不利因素也会增加罹患CRC的风险[9-10]。肿瘤形成的两个主要特征是血管生成和具有无限复制潜能的干细胞特性。目前研究认为大多数CRC的癌细胞来源于干细胞或干细胞样细胞[11]。从正常的肠黏膜上皮细胞逐渐发展为癌细胞，CRC的进程囊括了表观遗传变异和多种基因突变，如微卫星不稳定性(MSI)、CpG岛甲基化表型(CIMP)、18q杂合子丢失和BRAF、RAS等基因突变，其生物学过程复杂[12]。大多数CRC是由息肉引起，始于异常的隐窝，逐渐演变成癌前病变(如腺瘤、锯齿状息肉等)，最终发展为CRC，这一过程需要10～15年[9]。

早期CRC往往缺乏特异的临床表现和可观的生物标志物，延误了病情的发现，以致当临床确诊时大多数患者已处于中晚期，大大降低了其生存期限和生存质量。据统计，癌灶局部扩散的CRC患者的5年生存率为80%～90%；而当癌灶发生远处转移后，晚期CRC患者的生存期限明显下降，其5年生存率仅有12%[13]。被多个国家的权威指南或共识所推荐的以免疫化学法粪便隐血试验(FIT)和结肠镜检查为基础的两步法CRC筛查方案逐渐改变了这一现状。开展CRC筛查可发现癌前病变和早期的CRC，将CRC扼杀在萌芽中，显著降低了CRC的发病率和致死率[14-15]。但CRC逐渐趋于年轻化，Kasi等[16]研究发现，50岁以下的CRC患者数呈上升趋势，其中以直肠癌和左半结肠癌尤为常见。随着当今临床医疗技术水平的逐步发展，针对CRC的治疗策略也出现了多元化和个体化，包括内镜局部切除和手术病灶切除，术前低分期放疗和全身治疗，局部和转移性疾病的广泛手术，转移的局部消融治疗，以及姑息性化疗、靶向治疗、免疫治疗等[9, 13]。其中，手术切除仍是CRC治疗的基石，而手术切除联合标准的辅助化疗方案(如FOLFOX)是最常见的CRC治疗选择，并可显著延长患者无病生存期(DFS)和总生存期(OS)[9, 13, 17]。尽管如此，化疗方案仅对50%的患者产生治疗效果，使CRC最终发展为复发性和难治性疾病，从而导致其死亡率高[18]。因此，CRC仍是一个形势严峻的健康问题，诊断与治疗的时机是决定其预后的关键因素。早期诊断并及时、有效地采取合理的治疗方案，对延长患者生命期限、提高患者生存质量、降低国家癌症负担等具有重要的意义。目前亟待一种更有效的手段对CRC进行早期筛查和治疗。

2 circRNA与CRC

circRNA被发现在癌症的进程中起着不可或缺的作用，是继lncRNA、miRNA等之后新的肿瘤热点分子。与相应的癌旁组织有所不同，circRNA被发现在CRC组织中异常表达[8]。circRNA参与调控CRC的多个生物学过程，干预CRC的预后，有望成为CRC治疗的新靶点及其诊治、预后等方面的良好生物标志物，但相关机制有待进一步探明。

2.1 circRNA简述circRNA最早在20世纪70年代被发现于RNA病毒中。因缺乏可靠的检测手段，circRNA曾被一度认为是RNA异常剪接表达的副产物，其生物学功能被忽视并沉寂于科研圈中相当长一段时间。近十年来，随着高通量测序和生物信息学分析等技术和方法的发展，研究发现，哺育动物细胞中存在内源性非编码的circRNA，其特点是丰富、稳定、保守、特异[3]。与有5′-帽端结构和3′-尾端结构的线性RNA不同，circRNA通常是通过前体mRNA(pre-mRNA)的反剪接机制或外显子跳跃性产生，以共价键形式构成一首尾相连的独特闭合环状结构，既无5′-3′端的极性，也无多聚腺苷酸尾部，因而不易被RNA核酸外切酶或RNase R降解[19]。根据circRNA的组成，目前将其分为四类：ecircRNA (exonic circRNA，为转录本的反向剪切形成)、elcircRNA (exon-intron circRNA，为内含子保留的转录本反向剪切形成)、ciRNA (circular intronic RNA，套索内含子从pre-mRNA切除后进一步形成)和tricRNA (tRNA intronic circRNA，为pre-tRNA剪切后形成)[19-21]。circRNA具有作为ceRNA/miRNA的海绵、调节选择性剪接或转录或翻译、调控亲代基因的表达、充当RNA结合蛋白(RBP)的海绵作用或蛋白质支架、被翻译成肽或蛋白(由于分析和验证方法的局限性，目前报道较少)、产生一些伪基因等多种生物学功能，为人类基因组的“暗物质”提供了新的见解[22]。目前大多数研究着重于探索circRNA的生物发生的相关机制，对细胞最终如何降解circRNA的机制尚不清楚，相关研究实验也寥寥无几，推测细胞中可能存在一种或多种区别于RNA核酸外切酶和RNase R的核糖核酸酶参与circRNA的降解过程。最近，Liu等[23]经研究发现一种分泌的circRNA内切酶——RNase L，可以对circRNA产生降解作用。深入研究发现，circRNA主要存在于外泌体和血浆中，可作用于细胞的多个生物学过程，如分化、增殖、侵袭、迁移、凋亡、上皮间质转化(EMT)、癌变等，因而参与人体多种疾病的发生和进展，如神经退行性疾病等，尤其是在肿瘤中起着关键性作用，可能是致癌因子，也可能是抑癌因子，但其相关作用机制尚未完全明确[24-27]。

2.2 与CRC有关的circRNA多种circRNA可在CRC组织中异常表达，参与癌细胞的发生和进展过程，并影响其对化疗药物的敏感性，从而改变CRC患者的生存情况。本文总结了目前研究报道的与CRC相关的circRNA，发现大部分circRNA主要通过ceRNA/miRNA的海绵参与CRC的进程。进一步探明circRNA-miRNA-mRNA调控网络的相互作用，有望为CRC的靶向治疗提供新的依据(见表1)。

表1 目前经研究报道的与CRC相关的circRNA

2.2.1 circRNA与CRC的发生和进展：circRNA与CRC的发生和进展过程有着密不可分的联系。不同的circRNA在CRC组织中差异性表达，并通过不同的代谢通路对癌细胞发挥着双重调控作用，既可能是原癌基因，也可能是抑癌基因。大多数CRC的发生和进展与Wnt信号通路有关，Grasso等[50]发现，Wnt信号基因在所有CRC亚型中均发生显著突变，与CRC的免疫抑制密切相关。Wang等[28]通过qRT-PCR首次验证了hsa_circ_0071589在CRC组织中表达上调，利用siRNA转染CRC细胞株(HCT116细胞)而敲除hsa_circ_0071589后可抑制癌细胞的增殖、侵袭和迁移，进而推测hsa_circ_0071589可能是CRC的原癌基因。此外，他们还通过生物信息学分析发现hsa_circ_0071589可通过充当miR-600的海绵作用来促进zeste基因增强子同源物2(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)的表达[28]。EZH2是多聚梳抑制复合体2中具有酶活性的亚基，在肿瘤免疫、形成、转移、新陈代谢等方面有重要作用，EZH2超表达是多种实体肿瘤晚期和转移性的标志[51]。相反，另一组研究人员Wang等[48]通过qRT-PCR首次发现hsa_circ_0014717在CRC组织中表达显著下调，且与CRC的TNM分期、远处转移、预后不佳密切相关；过表达hsa_circ_0014717可显著抑制癌细胞的增殖、集落形成，体外诱导细胞周期阻滞于G0/G1期，体内抑制转移瘤生长。此外，他们通过免疫印迹法和qRT-PCR发现p16基因的mRNA和蛋白质在hsa_circ_0014717过表达的CRC细胞(HCT116和HT29细胞)中显著表达，敲除p16可逆转hsa_circ_0014717介导的CRC细胞的生长抑制，进而推测hsa_circ_0014717通过明显上调p16的表达来促进细胞周期阻滞，且hsa_circ_0014717可能是CRC的抑癌基因。由此可见，异常表达的circRNA在调控CRC的发生和进展过程中发挥着不可或缺的作用，这促使临床上发展以circRNA为导向的新颖的CRC治疗切入点成为可能。

目前CRC的常见肿瘤标志物有CEA、糖类抗原等，主要靠抽血检出，但肿瘤标志物升高并不代表机体一定存在肿瘤，还需要结合相关的影像学检查或活组织切片等。此外，CEA和糖类抗原等也在食管癌、胃癌、胰腺癌、胆管癌、肺癌等多种癌症中升高，缺乏可观的特异性。Wang等[48]通过hsa_circ_0014717在CRC组织和癌旁组织中的表达情况建立了ROC曲线(AUC=0.683，95%CI：0.578～0.776，P=0.001)，发现hsa_circ_0014717在CRC中具有较高的诊断学价值，推断其有望成为诊断CRC的潜在生物标志物。circRNA异常表达正逐渐成为影响癌症患者OS的独立危险因素[52-53]。Li等利用生存分析证实，当circRNA可能是原癌基因时，其表达上调与CRC患者的OS缩短密切相关(HR=2.66，95%CI：2.03～3.50，P=0.000)；而当circRNA可能是抑癌基因时，其表达下调与CRC患者的OS延长息息相关(HR=0.30，95%CI：0.17～0.53，P=0.00)[54]。就CEA或CA19-9阴性的CRC患者而言，其血浆中的circ-CCDC66、circ-ABCC1、circ-STIL可能是有效的诊断性生物标志物；而将circRNA与传统的肿瘤标志物(如CEA和CA19-9)结合有望提高CRC诊断的灵敏性和特异性，尤其是针对早期CRC[55]。因此，凭借独特的生物学结构和功能，circRNA有望成为CRC早期筛查与诊断的生物标志物，以及判断其预后的指标。

2.2.2 circRNA与CRC耐药：化疗是目前治疗晚期CRC的有效方法，而5-FU和OXP是其重要的治疗选择。然而，癌细胞可对5-FU和OXP产生耐药性，化疗耐药最终导致CRC患者出现病情恶化、复发甚至死亡的高风险，与CRC预后不良相关，这是临床上CRC化疗过程中需要克服的主要障碍。

过去大量研究均已证实，lncRNA、miRNA与各种癌症的耐化疗机制相关；而circRNA作为目前癌症界新兴的明星分子，被越来越多的研究发现，其异常表达在骨肉瘤、甲状腺癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、白血病、恶性胶质瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌、CRC等多种癌症中参与调控癌细胞的化疗耐药过程[56-57]，这提示circRNA可能是突破癌细胞耐化疗的关键分子。如circ-PVT1可在胃癌中发挥致瘤作用，且circ-PVT1在耐紫杉醇的胃癌细胞和组织中表达上调，通过海绵化miR-124-3p增强ZEB1的表达，从而促进化疗耐药的发生[57]。现研究circRNA调控CRC耐化疗的相关机制仍处于萌芽阶段。Xiong等[58]首次发现并报道了circRNA参与调控CRC细胞对5-FU耐药的作用机制，并根据KEGG通路分析结果认为circRNA参与介导癌症信号通路或癌症相关的信号通路，如放线菌-细胞骨架通路、局灶粘连信号通路、Wnt信号通路等，使击破CRC耐药这一障碍成为可能。Zhang等[30]也发现circHIPK3在复发的CRC患者的组织中表达上调，靶向miR-637/STAT3/Bcl-2/beclin1轴，通过自噬作用促进CRC对OXP产生耐药性；circHIPK3还与肿瘤大小、区域淋巴结转移、远处转移和生存相关，有望成为推断化疗患者预后的预测因子，进一步扩充了CRC研究领域的新视野。

目前，我们对CRC耐化疗的机制仍知之甚少，导致当今的治疗策略难以干预其中。外泌体是由哺乳动物的各种体细胞通过胞吐作用过程释放的纳米微泡，可用于细胞间通讯。癌细胞可分泌大量外泌体至体循环中，而外泌体在癌症的进程中发挥着侵袭、血管生成、免疫调节、耐药等多效性作用，这些外泌体可经液体活检提取出来，未来有望用于癌症筛查[59]。外泌体可将耐药癌细胞的核酸转移至药敏细胞中，以扩大癌细胞的耐药能力。如在胃癌中，外泌体可将miR-155-5p转移至受体细胞中进而增加对紫杉醇的耐药性[60]；来自癌相关成纤维细胞的外泌体可将lncRNA H19转移到CRC细胞中以增强对草酸铂的耐药能力[61]。另外，由CRC细胞释放的外泌体也可干扰肿瘤的耐药性[62]。而circRNA可在外泌体中富集[24]。Hon等[63]首次报道胞外囊泡来源的circRNA在CRC中具有耐药性，并从FOLFOX耐药的HCT116细胞系分泌的外泌体中发现了105个上调的circRNA和34个下调的circRNA；其中circ-0000338在耐药的HCT116细胞系及外泌体中的表达均显著上调，敲除circ-0000338可改善CRC细胞的耐药性；此外，通过qRT-PCR分析发现来源于CRC的外泌体可选择性地将circ-0000338从耐药癌细胞转移到药敏的对应细胞中，以调节CRC细胞的耐药性，进而提出circ-0000338可能在耐化疗的CRC中具有多重调控作用。由此可见，在CRC的研究领域中，探明circRNA与癌细胞耐化疗之间的分子机制对CRC的诊治有着举足轻重的作用，差异表达的circRNA可能是改善化疗耐药的治疗靶点，也可能是评估化疗患者的预后因子，但仍需要更深入的研究来阐明。

3 Fn与CRC

作为消化系统中一种常见的恶性肿瘤性疾病，CRC是由多因素和多阶段综合产生的，而肿瘤也逐渐形成繁复的机制来抵御机体的抗肿瘤免疫反应[64]。肠道微生物群包含1014个微生物，呈明显的个体化特征而被称为人体的“第二指纹”，通过各种复杂的机制调控肠道环境的平衡，影响着人体的免疫系统和健康状况[65-66]。据统计，大肠的细菌密度(每毫升约1012个细菌)远高于小肠的细菌密度(每毫升约102个细菌)，而值得注意的是，大肠的癌症风险是小肠的12倍[65]。可见，肠道微生物中的一些菌群影响着CRC的进程。Chen等[67]利用荧光原位杂交技术(FISH)证实Fn在CRC组织中富集。进一步研究发现，Fn参与CRC的发生、进展和耐药等过程，可能是CRC易感性的潜在“启动点”，而CRC组织中Fn的DNA数目可能将是CRC患者预后不良的生物标志物[68-70]。

3.1 Fn简述Fn是一种革兰氏阴性无芽孢厌氧菌，为口腔中常见的共生定植菌，是机会致病菌，常常被发现于人体不同部位的混合感染和慢性炎症中，如牙周炎、齿龈炎、胰腺炎、肝脓肿、宫内感染、炎症性肠病(IBD)等。Fn上的黏附素和毒力蛋白是促进其增殖和侵袭的重要因素[71]。Fn中含有一种黏附素——FadA，可与血管内皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)结合，从而增加内皮的通透性，进而促进Fn转移[72]。Fap2，为Fn中的另一种黏附素，能识别肿瘤组织中过表达的一种糖残基Gal-GalNAc，来调控聚集和血细胞凝集的作用[73]。Fn富集导致一系列特定的肿瘤相关的分子机制的发生，包括MSI、CIMP和BRAF、CHD7、CHD8、TP53的基因突变等，与口腔癌、胃癌、胰腺癌、CRC等多种癌症密切相关[68，74-75]。错配修复基因突变或启动子甲基化导致错配修复基因功能缺失，引起含有错配碱基核苷酸插入或错配缺失的DNA分子不能正常修复，引起广泛的MSI，这在CRC患者体内常发生。Fn与MSI相互作用影响机体的抗肿瘤免疫反应，且Fn可促进高MSI的CRC细胞发生免疫逃逸[76]。此外，Fn调控肿瘤的免疫微环境，通过下调T细胞介导的抗肿瘤免疫来促进结直肠肿瘤的发生[77]。一方面，Fn可募集髓源性抑制细胞进入肿瘤的微环境中，而髓源性抑制细胞可抑制T细胞的增殖、诱导其凋亡；另一方面，Fn上的毒力因素也可抑制T细胞的增殖[78]。这表明Fn对抗肿瘤的免疫微环境产生抑制的作用。在肿瘤的进程中，Fn富集、高MSI、低水平T细胞浸润之间相辅相成，发挥着重要的推动作用。经小鼠实验证实，Fn感染能增加癌细胞的增殖、侵袭和形成转移瘤的能力[6]。因此，Fn可影响肿瘤的进程，也有望成为一个新的治疗靶点或预后指标。

3.2 Fn可能是CRC的致癌菌近十年来，探明Fn与CRC之间的关系走在科学研究的前沿，随着相关研究日益增加，Fn潜藏在CRC中的“神秘身份”逐渐被揭开——Fn可能是CRC的致癌菌。经qPCR等方法发现CRC组织中Fn的丰度从直肠至盲肠逐渐增加[79]，且Fn富集于CRC组织和癌前病变中，包括腺瘤[68]，这暗示Fn丰度与病变部位相关。

大量研究试图探明Fn在CRC中致癌的作用机制。Rubinstein等[80]研究表明，Fn在正常组织、腺瘤、腺癌中逐渐增长，而FadA在Fn中高度保守，同样地，FadA在正常组织、腺瘤、腺癌中呈阶梯式增长。他们还发现，FadA与E-cadherin结合，并激活β-catenin信号通路，导致转录因子、致炎基因、致癌基因、Wnt基因的表达增加和CRC细胞的增殖，进而提升Fn在CRC中的致癌作用。此外，他们还发现一旦FadA与CRC细胞结合足以启动Wnt基因和致癌基因，但激活致炎基因还需要网格蛋白介导下FadA内在化作用的参与。另外，Chen等[67]还证实，在CRC组织中，Fn利用TLR4/P-PAK1网络来激活β-catenin信号通路。TLR4，为Toll样受体家族成员，是革兰氏阴性菌上脂多糖的受体，与肠道肿瘤形成有一定关系；而PAK1参与CRC的转移[67, 81]。Abed等[73]证实Gal-GalNAc在正常组织、腺瘤、腺癌中的生物合成逐渐增加，CRC组织中过表达的Gal-GalNAc能被Fn表面的Fap2识别并结合，进而促进Fn在CRC组织中富集。更深入研究发现，Fap2能介导Fn侵袭CRC细胞，在此过程中还能诱导促炎细胞因子IL-8、CXCL1的分泌，进而促进CRC细胞迁移，这与CRC的进程密切相关[82]。由此推测，靶向Fn上的FadA、Fap2或宿主上皮的Gal-GalNAc有望降低Fn在CRC组织中的致瘤作用。

化疗失败源于药物抵抗，这是导致CRC患者复发的最主要的原因。Fn在CRC复发的组织中丰度也较高，且Fn富集提示CRC患者可能有更低的无复发生存率，与CRC复发的预后不良相关[83-84]。Fn可通过TRL4/NF-κB通路上调BIRC3的表达而抑制caspase-3(为哺乳动物细胞凋亡通路下游关键的死亡蛋白酶)的生物学功能，最终促进CRC对5-FU产生耐药性[85]。此外，Yu等[84]发现Fn通过靶向固有免疫途径TLR4和MYD88而选择性降低miR-18a和miR-4802表达水平，来刺激自噬相关蛋白ULK1和ATG7的表达，进而激活癌症的自噬途径，最终可导致CRC对5-FU和OXP产生耐药效应。Lu等[85]利用慢病毒和siRNA敲低技术证实，Fn还可通过ANO1信号通路阻碍5-FU和OXP所触发的CRC细胞凋亡，进而产生耐药效应。可见，Fn是CRC复发和化疗耐药的潜在危险因素。

Komiya等[86]通过研究证实，CRC患者瘤内的Fn来源于口腔，暗示消化道可能是Fn传播的一潜在性途径。而另一项研究发现Fn也可经血液传播的方式定植于CRC病灶中[73]。最近，流行病学研究也开始着手探讨暴露因素及生活方式(如饮食习惯、使用抗生素等)在CRC进程中对Fn富集产生的影响作用[87-88]。高纤维的膳食摄入与Fn富集发生CRC的低风险相关[87]。另外，使用甲硝唑处理结肠癌异种移植的小鼠可减少Fn的负载、癌细胞的增殖、瘤体的生长[89]。因此，未来的治疗手段有望通过干预机体中Fn的水平来阻碍CRC的进程。对于Fn富集的CRC患者，标准的治疗策略将需要把抗Fn治疗也考虑在其中。

4 小结与展望

综上所述，我国CRC的发病率和致死率仍处于较高水平，形势不容乐观，目前亟待一种更有效的诊治策略来改善CRC患者的生存情况。circRNA、Fn均具有各自独特的优势。circRNA具有高度稳定性、丰富性、特异性等特征，可在CRC中异常表达；而Fn可能是CRC的致癌菌，可在CRC中富集。circRNA、Fn均通过多种不同的信号通路参与CRC的发生、进展和耐药等过程，有望成为潜在的CRC诊断和预后评估的新型生物标志物及治疗靶点。此外，对于同时富集Fn和高表达miR-21的CRC患者，circRNA有望成为潜在的治疗靶点。尽管我们在circRNA、Fn两个领域中已取得一些进展，但仍处于刚起步阶段，实际应用于临床诊治还需走很长的路，未来需要加大对circRNA、Fn在CRC进程中的研究，而我院消化内科正努力挖掘潜藏在三者之间的作用机制，推断Fn可能通过介导circRNA/miRNA途径而影响CRC的进程。