酿造技术对野生猕猴桃果酒有机酸组成及其品质的影响

刘淑珍，苏颖玥，陈红梅，常 远，袁春龙，2

（1.西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西杨凌 712100；2.陕西省葡萄与葡萄酒工程技术研究中心，陕西杨凌 712100）

野生猕猴桃在我国分布面积广泛，秦岭是主要的分布区之一，果实含有丰富的vitaminC（VC）、vitamin E、酚类等多种具有抗氧化作用物质，还含有多种生物活性物质，包括膳食纤维、氨基酸、矿物质及类胡萝卜素等[1]，有利于人体健康[2]，备受消费者喜爱[3]。但就目前来讲，野生猕猴桃果实小，采摘困难，推向市场的保存运输费用高[4]，导致其价值不能充分得到发挥。基于以上问题，酿造有特色的猕猴桃酒，有利于提高其利用率，助力山区居民的脱贫致富。目前，野生猕猴桃酒酿造仍存在一些问题，首先是果实成熟度不一致，难以控制，猕猴桃硬度会直接影响其酒的感官质量，包括香气强度、糖酸含量。成熟度低的猕猴桃坚硬，且糖酸比低[6]。研究表明，延迟采收或后熟软化都可以提高猕猴桃质量[7-8]。其次是果实中果胶含量高[9]，在榨汁过程中会导致猕猴桃酒出汁率较低，孙强等[10]、Towantakavanit[11]的研究表明，添加果胶酶可以有效提高出汁率，但温度的上升会加速VC 分解[12]，需要探究果胶酶合适的用量、时间和温度。再次是野生猕猴桃糖低酸高，康孟利[14]提出有机酸含量是影响猕猴桃酒质量的重要因素，虽然有机酸可以支撑酒体，使口感清爽醇厚，并起到抑菌的作用[13]，但若酸过高会使酒体失去平衡，产生不良口感。有研究发现利用D314 树脂对果酒中的有机酸和总酸的降低均有很好效果[15-16]。本研究旨在针对野生猕猴桃酒加工中存在的关键问题开展研究，以改善野生猕猴桃酒的品质，提高野生猕猴桃的利用率，促进当地经济的发展。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

材料：野生猕猴桃，采于陕西汉中佛坪。经测定，野生猕猴桃平均果重约为26.20 g/个；总还原糖含量为80.50 g/L；可滴定酸18.75 g/L；VC 含量约为1986.6 mg/kg；Brix 11%。

试剂：大孔树脂（D314）、果胶酶，上海鼎唐国际贸易有限公司；浓硫酸（＞99.8 %）、超纯水、草酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、奎宁酸、琥珀酸、乙酸，西陇化工股份有限公司。以上试剂均为分析纯；商业酵母OFD，德国Erbsloh集团。

仪器设备：果实硬度计（GY-3），艾德堡仪器有限公司；高效液相色谱仪（LC-20A），日本岛津公司；雷磁pH 计（PHS-3C），上海精密科学仪器有限公司；离心机（5424R），Eppedorf 公司；鼓风干燥箱（DGX-9243BC），上海南荣实验室设备有限公司；低温冰箱（DW-25W203），澳柯玛股份有限公司；超声波脱气机（AS 3120B），天津奥特赛恩斯仪器有限公司；色谱柱（150×7.8 mm），美国菲罗门公司；抽滤机（AP-01P），天津奥特赛恩斯仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 工艺流程及操作要点

1.2.1.1 猕猴桃酒酿造工艺（参考李华[17]的方法）

野生猕猴桃→分选清洗→破碎压榨→猕猴桃汁→接种酵母→启动发酵→发酵监控→终止发酵→倒罐→澄清稳定→贮藏

1.2.1.2 操作要点

选择成熟度较好且基本一致的猕猴桃进行清洗、压榨，压榨后过滤皮渣，用猕猴桃清汁发酵，添加60 mg/L 的SO2，酵母37 ℃活化20 min 后再添加，酵母菌接种量为200 mg/L，发酵温度18～20 ℃，根据猕猴桃糖含量计算添加白砂糖，使发酵前糖含量为240 g/L，最终酒精度达到12 %（D314树脂柱对酒度的影响忽略不计），监控发酵过程中的温度、比重，以残糖＜4 g为发酵完成。

1.2.2 研究内容

1.2.2.1 后熟过程监控

挑选成熟度较为一致的野生猕猴桃数组，每10颗一组，储藏。每天随机挑选一组，测定其中部和两端的硬度，取猕猴桃压榨汁，分别测定总还原糖含量、酸度、pH 值及可溶性固形物含量，并绘制在后熟过程中硬度与糖含量随后熟时间的变化曲线。

1.2.2.2 野生猕猴桃汁酶解条件对果实出汁率的影响

以酶解温度，果胶酶添加量和酶解时间为变量，以出汁率和VC 含量为因变量，进行单因素试验，研究这3 种因素对猕猴桃出汁率的影响，根据单因素实验的结果，找到这3 种因素较为合适的范围，选择果胶酶用量20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L，酶解时间2 h、4 h、6 h，酶解温度35 ℃、45 ℃、55 ℃进行正交试验。

1.2.2.3 D314 树脂对野生猕猴桃酒降酸效果的研究

以果汁直接发酵不降酸处理的野生猕猴桃酒为对照组，以果汁发酵前降酸及发酵完成后降酸处理为实验组，实验组采用D314 弱碱性树脂降酸处理，方法均参照郝雅兰[18]的方法，并略作调整：酒样流速为17.5 mL/L；树脂量10 mL 过滤柱：10×200 mm。

1.2.3 主要测定指标及方法

1.2.3.1 有机酸含量

①标准品的配制：分别配制浓度为5 g/L、5 g/L、5 g/L、2 g/L、0.5 g/L、1 g/L、10 g/L 的苹果酸、柠檬酸、奎宁酸、酒石酸、草酸、琥珀酸、VC 标准样品溶液，再按此浓度配制混合标准品溶液，并进行梯度稀释，以峰面积（X）对质量浓度（Y）求回归方程和相关系数，绘制各种有机酸的标准曲线。

②样品预处理：将野生猕猴桃破碎制浆，10 min后取汁，5000 r/min 离心20 min 后取出，弃沉淀保留上清液。将制取的野生猕猴桃果汁及果酒经过0.22µm 微孔滤膜过滤，等待进样。

③色谱条件：流动相A/B：0.025 μg/mL 硫酸溶液（0.36 μL 定容至1000 mL 容量瓶）；柱温：25 ℃；流速：0.3 mL/min；检测波长：210 nm；进样量：20µL。

1.2.3.2 香气成分

搅拌棒萃取-气相色谱-质谱测定方法测定[20]。

1.2.3.3 基本指标的测定及方法

还原糖（葡萄糖计）、总酸（酒石酸计）、可溶性固形物、pH 值、游离SO2、挥发酸（醋酸计）、酒精度等常规指标的测定参照王华[19]的方法，所有指标均重复测定3次。

1.2.3.4 感官评价和分析

根据苏鹏飞[21]葡萄酒感官评价方法进行猕猴桃酒的感官评价。

1.2.3.5 数据处理

采用SPSS 17.0 和Excel 2010 进行数据处理，结果表示为平均值±标准偏差；用Origin 9 进行作图。

2 结果与分析

2.1 野生猕猴桃的后熟控制

低糖高酸是野生猕猴桃的重要特点[22]，在酿造过程中常通过调整糖分来提高酒精度，目前，国内外均以可溶性固形物含量作为果酒加工参照条件[23-24]，宋于洋等[25]认为，糖酸比可作为野生猕猴桃成熟度指标。在本实验中以糖酸比作为后熟过程中的主要酿造技术指标。酸含量与总还原糖量之间的关系如图1 所示。由图1 可知，在室温条件下，随着野生猕猴桃储藏时间延长，果实总还原糖含量呈缓慢增加的趋势，且在13 d 时达到最大，之后缓慢下降，这与已报道的研究结果一致[26]；猕猴桃的酸含量缓慢下降，但是在储藏后期基本保持不变的状态。在13 d 时其果实糖酸比最大，但是由于13 d糖含量开始显著下降，所以认为12 d 的糖酸比5.83为佳。

图1 采后成熟过程中糖酸变化

从图2可知，在储藏过程中，野生猕猴桃总还原糖含量随硬度的下降而上升，在一定时间后，总还原糖含量有下降的趋势，这可能是因为前期果实中的淀粉分解使得糖含量升高，而后期果实新陈代谢消耗掉一部分糖所致，即当硬度在0.5～0.6 kg/cm2范围内，糖含量达到最大，此时被认为是后熟过程中的最佳成熟点，也是猕猴桃成熟度控制主要酿造技术指标之一，这与糖酸比达到最大时的时间点相对应。在猕猴桃成熟过程中，其生理、组织会发生一系列的变化，硬度随后熟过程急剧下降[27]。本实验所使用的猕猴桃，后熟过程中硬度变化在0.39～1.15 kg/cm2之间。

图2 采后成熟过程中果实硬度的变化

2.2 果胶酶对野生猕猴桃出汁率的影响

2.2.1 果胶酶单因素实验

由图3 可知，在25～65 ℃的酶解温度范围内，出汁率由52.63 %（25 ℃）增加到53.68 %（55 ℃），出汁率变化不大，但是，VC 含量变化明显，由1900.32 mg/L降低到890.13 mg/L。随着酶解温度的升高，猕猴桃汁中的VC 含量明显下降，且下降速度较快，符合高温会加速VC 分解速率的情况。结合VC 的变化，35 ℃的酶解温度合适，出汁率和VC 含量都处于较高水平，可以缩短加工时间。

图3 酶解温度对野生猕猴桃出汁率及VC含量的影响

由图4 可知，在0～40 mg/L 的果胶酶添加范围内，出汁率从32.7%增加到44.87%，出汁率显著提高，当果胶酶添加量大于60 mg/L 后，出汁率增加的幅度降低，差异不显著；而不同的果胶酶添加量对VC 含量影响较小，甚至没有影响。综合分析，认为果胶酶添加40 mg/L最合适。

图4 果胶酶添加量对出汁率及VC含量的影响

图5 酶解时间对野生猕猴桃出汁率及VC含量的影响

从图5 可知，在温度、果胶酶含量不变的条件下，酶解时间从0 h 增加到4 h，猕猴桃出汁率由31.9%增加到46.62%，在4～8 h 的时间范围内，出汁率几乎保持不变；整个酶解过程中VC 含量变化显著，从1984.64 mg/L 降低至665.05 mg/L，4 h 时的出汁率达到最大值（46.62 %）。结合VC 含量的变化，4 h的酶解时间最合适。

2.2.2 出汁率的正交试验设计及结果分析

根据单因素实验的结果，选择果胶酶（A）用量20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L，酶解时间（B）选择2 h、4 h、6 h，酶解温度（C）选择35 ℃、45 ℃、55 ℃进行正交试验，结果见表1。

由表1 可得出，野生猕猴桃出汁率优化条件的最优组合是：A3B3C3，即果胶酶添加量为60 mg/L、温度55 ℃、时间6 h；对该条件进行验证实验，得到出汁率为57.77 %，VC 含量为1674.8 mg/L。通过极差分析可知，影响出汁率的主次顺序为：A＞C＞B，即果胶酶用量对出汁率的影响最大，其次是酶解温度和酶解时间。

表1 果胶酶提高出汁率的正交试验

2.3 野生猕猴桃酒降酸处理

2.3.1 有机酸的定性定量分析通过保留时间对6 种有机酸进行定性，利用不同浓度对应的有机酸峰面积计算出该物质回归方程，参照回归方程对样品有机酸物质进行定量分析。有机酸的出峰顺序为：草酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、奎宁酸、琥珀酸。

2.3.2 不同降酸方式对野生猕猴桃酒品质的影响

2.3.2.1 不同降酸方式对有机酸组成及含量的影响

图6 不同降酸方式对有机酸影响

由图6 可知，利用D314 树脂降酸后，野生猕猴桃酒的可滴定酸含量显著下降（p＜0.05），达到果酒标准，猕猴桃酒中的有机酸含量变化很大。

2.3.2.2 不同降酸方式对猕猴桃果酒香气物质的影响

发酵开始前降酸和发酵完成后（残糖＜4 g/L）降酸，比较不同降酸方式对香气物质的影响。

由表2 可知，发酵后降酸处理的猕猴桃酒的香气总含量（43949.26 μg/L）高于发酵前降酸处理（12968.31 μg/L），而低于对照组（62714.67 μg/L），三者之间存在显著性差异（p＜0.05）。经实验表明，大孔树脂D314 降酸会影响猕猴桃酒中的香气物质种类及含量，共检出酯类19 种，发酵前降酸处理使丁二酸二乙酯、棕榈酸乙酯含量分别降低85%、41%，但是发酵后处理则能使这两种物质分别增加9%、22%。两种处理使乙基己酸十八醇酯含量有少量下降，但该物质本身含量较低，不是主要香气物质组成成分。总体来说，经过发酵前降酸处理的酯类物质减少较多，约为86%；而经过发酵后降酸处理的酯类物质有稍微的增加，基本保持不变，说明发酵后降酸处理比发酵前降酸处理能更好地保留酯类香气物质。

不同酒样中共有3 种醇类物质被检出，发酵后降酸的酒样中各醇类物质含量及总含量（3386.65 μg/L）与对照组含量相当（3324.67 μg/L），而显著高于发酵前降酸处理酒样中的醇类物质含量（463.80 μg/L）。发酵后降酸处理并不影响酒中

的醇类物质含量，而发酵前降酸处理酒样中醇类物质含量显著降低，这可能是因为树脂在降低猕猴桃汁有机酸的同时，将生成醇类物质的前体物质带走，严重影响了猕猴桃酒的整体香气质量及口感。

表2 不同降酸方式对香气物质的影响

3 种酒样中共检测出萜烯类物质7 种。对照组中的萜烯类物质含量最高（1473.79 μg/L），其次是发酵前降酸处理酒样（337.17 μg/L），发酵后降酸处理酒样中萜烯类物质含量最低（281.89 μg/L），降酸处理会显著减少猕猴桃酒中的萜烯类物质含量，使猕猴桃酒的整体香气有缺陷。

3种酒样中共检测出酸类物质16种，共同含有的物质有12种。发酵后降酸处理酒样中的酸类物质总量（31925.68 μg/L）低于对照组（40096.64 μg/L），而显著高于发酵前降酸处理酒样中的酸类物质含量（7613.06 μg/L）。对照组酸类物质含量较为突出的有：辛酸、癸酸、十二碳酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕榈酸和7-十六碳烯酸。利用D314 过滤后，酒样中的酸类物质显著降低，特别是利用过滤后的果汁进行发酵的猕猴桃酒中，其酸类物质含量约为对照组酸类物质含量的1/6。酸类物质含量及组分对酒的感官评价有显著影响，但并不是酸类物质含量越低，酒的酸度越低，可接受性能越强。

2.3.2.3 不同降酸方式对野生猕猴桃酒感官品质的影响

图7 不同降酸方式对野生猕猴桃酒感官QDA的影响

从图7 可知，发酵后降酸处理的酒样澄清度、颜色、口感纯正度、口感浓度及整体平衡方面均高于对照组和发酵前降酸处理酒样；对照组猕猴桃酒在香气纯正度、香气质量、香气浓度方面均高于发酵前降酸处理酒样，说明D314 弱碱性树脂降酸会降低野生猕猴桃酒的香气质量及浓郁度；发酵前降酸处理的酒样感官可接受度较高，但其香气、口感及整体平衡性较差，这可能是因为树脂对果汁进行降酸处理带走了香气前体物质；综合分析可知，降酸处理会影响野生猕猴桃酒的香气感官质量及典型性，发酵前降酸处理不适合野生猕猴桃酒发酵，发酵后降酸处理可以有效保存野生猕猴桃酒的香气特征，且通过降酸处理后整体平衡性提高。

图8 不同降酸方式对野生猕猴桃酒香气QDA的影响

从图8 可知，对照组猕猴桃酒的果香、花香、猕猴桃品种香、草药及生青味均高于降酸处理的酒样；发酵后降酸处理后酒中的矿物质味、品种香、柑橘类香气与对照组差别不大，说明发酵后降酸处理可保留猕猴桃特征香气物质；发酵前降酸处理后酒样的整体香气质量相对较差，品种特征香味不突出。因此，利用D314 大孔树脂对野生猕猴桃酒降酸时，应该采用发酵后降酸处理的方式，降低有机酸及可滴定酸含量的同时，可最大限度地保留野生猕猴桃的品种香气。

3 结论

本实验比较D314 弱碱性树脂对猕猴桃酒的两种降酸处理有机酸和品质的影响，对秦岭野生猕猴桃酒加工技术有一定指导和参考意义。结果表明，该树脂可使猕猴桃酒的总酸显著下降（18.26～7.55 g/L），达到猕猴桃酒国家标准QB/T 2027—1994 的规定，有机酸组成有显著差异（p＜0.05），与对照组和发酵前降酸处理相比，发酵后降酸处理猕猴桃酒香气物质含量更高，能更好地保存猕猴桃酒的14 种特征香气，香气物质包括醇类、酯类、萜烯类、酸类及其他种类，其中果香、柑橘类香气和猕猴桃品种香气较为突出，在感官质量综合分析中也有很好表现，且对果酒中其他理化性质影响较小，被认为是一种较好的降酸方式。为猕猴桃酒降酸提供新的参考方式，有助于提高猕猴桃酒整体品质，此工艺的最佳条件及适用性仍需进一步研究。