三氯化铁絮凝小球藻的采收工艺

（江苏科技大学生物技术学院，江苏 镇江 212018）

小球藻 (Chlorellasp.) 是一种单细胞绿藻，细胞直径3～8 μm，有光合效率高、生长速率快等特点[1]，且富含蛋白质、多糖、脂肪酸、色素和维生素等营养成分，在食品、饲料、化工、能源等领域有广阔的应用前景[2]。此外，小球藻有降血糖、血压、血脂等功效，对预防和治疗心脑血管疾病有较好效果，甚至可抑制肿瘤细胞的生长[3]。但由于其个体微小、培养浓度低等原因，采收工艺和成本一直是困扰其规模化生产的关键技术问题之一。有数据显示，小球藻的采收成本占其生产成本的20%～30%[4]。因此，探索一种效率高、成本低、操作简单的采收工艺是当前小球藻规模化生产过程中亟需解决的问题。

目前，小球藻的采收方法主要有离心分离法、过滤分离法和化学絮凝法等[5-6]。离心分离法是规模化采收小球藻时普遍使用的方法，但此法设备投资大、能耗高，离心力较大时会破坏藻细胞，影响其生理活性[7]。过滤分离法采收效率易受滤膜孔径影响，且存在滤膜清洗更换费用高、易污染等问题[8-9]。化学絮凝法有效率高、成本低、易控制、操作简单等特点，已广泛应用于微藻采收。絮凝剂是采收效果的决定因素。常用于采收微藻的絮凝剂有FeCl3、石灰和明矾，以FeCl3最为常用。三氯化铁对球等鞭金藻 (Isochrysis galbana) 采收效率超90%[10]，对三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutumBohlin）的采收效率超过95%[11]。目前关于三氯化铁对小球藻的絮凝采收已有报道。刘国记[12]和左志鹏等[13]研究了不同浓度的FeCl3对小球藻絮凝效率的影响；张文君[14]研究了絮凝时间和FeCl3用量对小球藻絮凝效果的影响；赵奎等[15]研究了氯化铁等8种不同的化学絮凝剂对小球藻絮凝效果的影响。这些研究均考察单因素对采收效果的影响，缺乏多因素综合影响采收效果的研究，关于三氯化铁对小球藻的絮凝采收效果和工艺条件还有待进一步研究。本研究在分析三氯化铁浓度、小球藻初始浓度、絮凝时间等工艺参数对小球藻采收效率影响的基础上，进一步通过响应面法优化三氯化铁絮凝采收小球藻的工艺条件，为规模化采收小球藻提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1主要试剂 六水合氯化铁 (FeCl3·6H2O) 购自国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2藻种 小球藻 (Chlorella sorokiniana,FACHB-275) 购自中国科学院淡水藻种库。在无菌条件下，将小球藻转接到BG11培养基中进行同步化培养，至对数生长期后再进一步扩大培养 （培养条件：温度25 ℃，照度3 000 lx，光暗周期为12 h L:12 h D）。步骤为：先确定小球藻的浓度，将小球藻质量浓度调至0.20 g/L左右，置于智能光照培养箱 (GXZ型，多段编程，宁波江南仪器厂) 中通气培养。培养条件：温度25 ℃，照度3 000 lx，光/暗周期为12 h L/12 h D,CO2体积分数为1.0%。绘制小球藻生长曲线，判定其生长前期、指数生长期、稳定期和凋亡期等生长阶段。

1.2 单因素实验

1）设置絮凝时间为30 min，小球藻初始质量浓度为0.42 g/L，FeCl3质量浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4和1.6 g/L；2）设置FeCl3质量浓度为0.6 g/L，小球藻初始质量浓度为0.42 g/L，絮凝时间分别为0、5、10、15、20、30、40、60和120 min；3）设置FeCl3质量浓度为0.6 g/L，絮凝时间为30 min，小球藻初始质量浓度分别为0.14、0.28、0.42、0.55和0.69 g/L。分析FeCl3浓度、絮凝时间和小球藻初始浓度对采收效率的影响。

1.3 响应面分析

根据单因素实验结果，利用Design-Expert软件的Box-Behnken模型设计实验进行响应面分析，优化影响采收小球藻效率的3个工艺参数，即絮凝剂质量浓度（X1）、絮凝时间（X2）、藻液初始质量浓度（X3）（表1）。

表1 用FeCl3采收小球藻工艺的因素水平Table 1 Factors and levels of harvesting technology for Chlorella sorokiniana using FeCl3

采用Design-Expert 8.0.6.1软件对相关数据进行回归分析，从而得到这3个因素一次效应、二次效应、交互效应的关联方程，以此为参照，对采收小球藻的工艺条件进行优化。

1.4 采收效率测定

在680 nm波长下，小球藻藻液具有最大吸收波长。用紫外可见分光光度计 (UV-1800PC型，上海美谱达仪器有限公司) 测定小球藻藻液在680 nm波长下的光密度值(x)，其值与其细胞浓度成线性关系[16]，并以此确定小球藻生物量 (y)。

其中，X0表示小球藻的初始质量浓度，Xt表示絮凝时间为t时小球藻的质量浓度。

2 结果与讨论

2.1 FeCl3浓度、絮凝时间和初始浓度对小球藻采收效率的影响

图1_a表明，当FeCl3质量浓度小于0.6 g/L时，小球藻采收效率随FeCl3质量浓度的增加而增大，最大采收效率为90.17%。这是因为Fe3+可通过中和藻细胞表面的负电荷，降低藻细胞之间的静电斥力，使其形成聚集体，可见Fe3+浓度越高越有利于藻细胞的沉降；此外，Fe3+还可在一定条件下形成难溶性盐，以网捕沉淀和吸附架桥等方式作用于藻细胞，进一步促进藻细胞的沉降[18]。因此，随着FeCl3浓度的增加，藻细胞与絮凝剂之间的接触机率增大，从而使小球藻的采收效率增加。但随FeCl3质量浓度的继续升高（大于0.6 g/L时），小球藻采收效率开始下降，这可能是因为FeCl3过多时，不仅破坏藻细胞，还会引入大量正电荷，过量的正电荷在系统中相互排斥，从而使采收效果减弱，如当FeCl3质量浓度大于1.6 g/L时，采收效率显著降低，与以FeCl3为絮凝剂分别采收凯氏拟小球藻(Parachlorella kessleri）和普通小球藻(Chlorella vulgaris）的结果[12,14]相近。

图1 FeCl3浓度、絮凝时间和初始浓度对利用FeCl3采收小球藻效率的影响Fig.1 Effects of FeCl3 concentrations,flocculation time,and initial concentrations on the harvesting efficiency of Chlorella sorokiniana using FeCl3

由图1_b可知，当FeCl3质量浓度为0.6 g/L、藻液初始质量浓度为0.42 g/L时，小球藻采收效率随絮凝时间的增加而显著上升，在絮凝30 min后达到较高水平，而当絮凝时间大于30 min时，采收效率基本稳定，与张文君[14]以FeCl3为絮凝剂采收普通小球藻的结果相近。这是因为絮凝时间越长，藻细胞与絮凝剂之间以及与藻细胞之间接触越紧密，相互结合并沉降，因而采收率较高。但一定时间后，采收率基本稳定，继续增加絮凝时间采收率变化不大。主要原因可能是小球藻表面的阴离子与絮凝剂FeCl3中的Fe3+的结合已达到饱和状态，继续增加絮凝时间并不会增加小球藻的采收率。赵奎等[15]在研究利用FeCl3采收埃氏小球藻(Chlorella emersonii)的过程中发现，絮凝效率随絮凝时间的增加而增大，达到最大值后，随着絮凝时间的延长，采收率变化不大；左志鹏等[13]研究表明，当FeCl3质量浓度为0.6 g/L时，絮凝时间为30 min，小球藻细胞采收率最大，与本研究结果相近。

由图1_c可知，在FeCl3质量浓度为0.6 g/L，絮凝时间为30 min条件下，小球藻初始质量浓度在0.14～0.42 g/L时，小球藻采收效率随其初始质量浓度的升高而增大，0.42 g/L时采收效率达最大值（90.06±0.29）%。而当小球藻初始浓度继续升高时，采收效率开始下降。这与张海阳等[19]结果基本一致，他们认为藻液浓度越大，采收效果越好，但当藻细胞浓度过大时，藻细胞所带负电荷多于絮凝剂电离产生的正电荷，过多的负电荷相互排斥，又导致采收率下降[20]。

2.2 利用响应面法进行采收条件优化

2.2.1Box-Behnken中心组合优化 为优化采收工艺参数，共设计17个实验点，其中有12个是析因实验，另外5个为中心实验，析因实验点自变量选择X1、X2、X3构成的三维顶点，其中零点区域为中心点，并在该区域重复5次 (表2)，以此估计实验误差[21]。

表2 采收工艺的响应面试验设计方案及结果Table 2 Design and results of response surface tests for the harvesting technology

2.2.2回归方程的建立与检验 用Design-Expert 8.0.6.1软件对表2数据进行回归分析，可得FeCl3浓度（X1）、絮凝时间（X3）和小球藻初始浓度（X2）对小球藻采收效率 (Y) 影响的二次多项回归方程：

根据该二次多项回归方程的方差分析和显著性检验结果 (表3)，此回归模型较为显著 (P=0.0246 ＜ 0.05)，失拟项不显著 (P=0.0533 ＞ 0.05)，且校正的R2=0.861 8，精确度（Adeq Precisior,AP）为7.578 ＞ 4。可见，此回归方程的拟合度和可信度均达较高水平。由回归方程系数显著性检验结果可知，方程一次项X2对小球藻采收效率的线性效应较为显著，但X1和X3对小球藻采收效率的线性影响则较不显著，各因素一次项对小球藻采收效率的影响顺序依次为X2＞X1＞X3；交互作用项中X1X2对小球藻的采收效率有较显著影响；二次项中X12对小球藻的采收效率有极显著影响，其余项对小球藻采收效率的影响均不显著。因此，在利用FeCl3采收小球藻时，小球藻初始浓度对小球藻采收率的影响最显著，所以首先需调节小球藻的初始浓度；考虑到3个因素间交互作用中，FeCl3浓度和小球藻初始浓度间的交互作用对采收率的影响最显著，因此，合理控制这两者的交互作用，亦可提高小球藻的采收率。此外，对FeCl3采收小球藻的各项条件进行优化后，获得的最大采收效率比马志欣等[22]利用聚合氯化铝采收普通小球藻时获得的最大采收效率高2.75%，说明FeCl3是适合采收小球藻的一种无机絮凝剂，可在规模化采收小球藻时推广应用。

表3 小球藻采收工艺条件优化的回归方程方差分析及其系数显著性检验Table 3 Variance analysis of regression equation and significance test of coefficient for optimizing harvesting conditions of Chlorella sorokiniana using FeCl3

2.2.3小球藻采收因素间的交互作用分析 利用Design-Expert 8.0.6.1软件，根据回归方程绘制图像进行分析，得到响应面图（图2）。图2_a可见，当絮凝时间为45 min时，FeCl3浓度和小球藻初始浓度的交互作用对小球藻采收效率的影响为显著水平，当絮凝时间一定时，随着FeCl3浓度的增加采收效率先升高后下降，同样，随着小球藻初始浓度的增加，采收效率亦先升后降，即当FeCl3浓度处于中水平，小球藻初始浓度也处于中水平时，小球藻的采收效率处于高水平。由图2_b可知，当小球藻初始质量浓度为0.42 g/L时，FeCl3浓度和絮凝时间的交互作用对小球藻采收效率的影响不显著，即当小球藻初始浓度一定时，随着FeCl3浓度的增加采收效率先升高后下降，而随着絮凝时间的增加，采收效率是逐渐上升的，并且缓慢达到一个较高水平，即当FeCl3浓度处于中水平，絮凝时间处于高水平时，小球藻的采收效率处于较高水平。图2_c显示，当FeCl3质量浓度为0.6 g/L时，小球藻初始浓度和絮凝时间的交互作用对小球藻采收效率的影响不显著，即当FeCl3浓度一定时，随着小球藻初始浓度的增加，采收效率先快速升高后略有下降，并在初始质量浓度为0.42 g/L时采收效率达到较高水平，另外随着絮凝时间的增加，采收效率亦逐渐上升，最后达到一个较高水平，即当小球藻初始浓度处于较高水平，絮凝时间处于高水平时，小球藻的采收效率处于较高水平。

2.2.4最优工艺参数的确定 根据上述Box-Behnken模型给出的数据和图像分析可得出，利用FeCl3采收小球藻的最优工艺参数，分别为FeCl3质量浓度为0.64 g/L，小球藻初始质量浓度为0.55 g/L，絮凝时间为38.01 min，在此工艺条件下，所得小球藻采收效率的理论值为96.72%。考虑到实际操作情况，将FeCl3采收小球藻的最佳工艺条件修正为FeCl3质量浓度为0.6 g/L，小球藻初始质量浓度为0.55 g/L，絮凝时间为38 min，以检测响应面法所预测的最优工艺的可靠性。通过检验，实际测得小球藻在此工艺条件下的采收效率达到 (98.57±1.85)%，这与采收效率理论预测值的误差为1.91% (＜ 5%)，表明通过响应面法实验得到的最优采收工艺参数切实可行。此外，通过响应面法对小球藻采收条件进行优化后，找到既节省成本和时间，小球藻采收效率又高的最佳工艺条件，比薛蓉等[23]未优化采收条件的采收效率高6.3%。

图2 小球藻初始浓度与FeCl3浓度 (a)、絮凝时间与FeCl3浓度 (b)、絮凝时间与初始浓度 (c) 的交互作用对采收效率的影响Fig.2 Interaction effects of initial concentrations and FeCl3 concentrations (a),flocculation time and concentrations of FeCl3 (b),and flocculation time and initial concentrations (c) on the harvesting efficiency of Chlorella sorokiniana using FeCl3

3 结论

本研究通过单因素实验研究FeCl3浓度、絮凝时间、小球藻初始浓度等3个因素对小球藻采收效率的影响，并利用响应面法优化利用FeCl3采收小球藻的工艺参数，可获得如下结论：

1）利用FeCl3絮凝采收小球藻的最优工艺条件为小球藻初始质量浓度0.55 g/L，FeCl3质量浓度0.6 g/L，絮凝时间38 min，在此条件下，所得小球藻采收效率为 (98.57±1.85)%。

2）影响FeCl3絮凝采收小球藻的各因素一次项顺序为小球藻初始浓度 ＞ FeCl3浓度 ＞ 絮凝时间。