pH/光双敏感含偶氮苯聚合物分子的设计及药物载体的应用

刘天奇， 雷 彬， 徐首红， 刘洪来

（华东理工大学上海多级结构纳米材料工程技术研究中心，化学与分子工程学院，上海 200237）

为了实现药物的靶向输送和可控释放，各种能够响应环境刺激如pH[15-16]、温度[17-18]、光[19-20]、氧化还原电位[21-22]、超声波[23-24]、酶[25]等的刺激响应型聚合物胶束被不断发展起来。由于肿瘤细胞的恶性增殖、营养缺乏导致糖酵解和乳酸积累，使肿瘤部位具有不同于正常组织的pH 值，如相比于正常的组织环境（pH=7.2～7.4），肿瘤组织的pH 为6.4 左右，并且肿瘤细胞内从早期核内体（pH=6.0～6.5），晚期核内体（pH=5.0～6.0）到溶酶体（pH=4.5～5.0）也存在着pH 梯度变化，所以pH 刺激常被作为设计刺激响应型药物载体的内源刺激[26-28]。聚甲基丙烯酸二异丙胺基乙酯（PDPA）就是能够响应pH 刺激的聚合物，在不同的pH 环境下能够发生质子化或去质子化，从而使亲疏水性发生改变。光是一种非接触式的外源刺激，波长和强度都能够被远程控制，也常被应用于药物载体的设计中。偶氮苯（AZO）是光响应型的官能团，偶氮苯分子存在顺式和反式两种异构体，在紫外或可见光照射下能够发生可逆的光异构化反应，从而引起空间结构或亲疏水性的变化[29-32]。

多重刺激响应型聚合物能够对两种或多种刺激敏感，能够适应肿瘤部位复杂的生理环境，在癌症的药物递送和治疗中显示出了巨大的潜能。本文设计、合成了3 种具有不同聚合度的pH 和光双重敏感的聚合物C10-AZO-C10-PDPAn-聚乙二醇（PEG45）（n=30,50,80），并探究聚合物的双重敏感性以及聚合物形成的胶束的基本性质，进而筛选出适合肿瘤部位药物递送的聚合物C10-AZO-C10-PDPA30-PEG45，研究此聚合物包载抗癌药物阿霉素的体外释放行为以及其生物相容性。

1 实验部分

1.1 实验试剂及设备

甲基丙烯酸二异丙胺基乙酯（DPA，w=98%，百灵威科技有限公司）；聚乙二醇单甲醚(mPEG2000,w=98%，百灵威科技有限公司)；2-溴代异丁酰溴(w=98%,百灵威科技有限公司); N,N,N',N″,N″-五甲基二亚乙基三胺(PMDETA, 分析纯,上海化成工业发展有限公司)；CuBr(分析纯，经冰醋酸、乙醇洗涤3 次,干燥后待用)；芘（w=99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）; 盐酸型阿霉素（DOX·HCl，w=98%，百灵威科技有限公司）；四氢呋喃（THF，分析纯，上海泰坦试剂有限公司，使用前重蒸除水）；甲醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；二氯甲烷(分析纯, 上海泰坦试剂有限公司，使用前经氢化钙处理)；中性三氧化二铝（200～300 目（75～48 μm），上海莲花有限公司），碱性三氧化二铝（200～300 目（75～48 μm），上海莲花有限公司）；人肝癌细胞株（Huh7 细胞，美国菌种保藏ATCC），人肾上皮细胞系（HEK-293T，美国菌种保藏ATCC），细胞毒性试剂盒（CCK-8, 日本同仁化学研究所）、无血清培养基(DMEM, 美国Gibco 公司)、热灭活胎牛血清（FBS, 美国Gibco 公司）。

动态光散射仪（DLS, Zetasizer Nano ZS90，英国马尔文公司）；紫外-可见分光光度计（UV-2450，日本岛津公司）；荧光分光光度计（F-4500，日本日立公司）；凝胶渗透色谱仪（GPC，PL-GPC50，英国马尔文公司）；透射电子显微镜（TEM，JEM-1400，日本电子株式会社）；核磁共振测定仪(NMR, AVANCEⅢ 500，德国 Bruker 公司)；倒置显微镜（EVOS x1，美国AMG公司）；荧光显微镜（EVOS FL，美国AMG 公司）；微孔板分光光度计（xMark Microplate Spectrophotometer，美国Bio-Rad 公司）。

1.2 分子引发剂C10-AZO-C10-OBr 的合成

在干燥的单口烧瓶中加入0.4211g C10-AZOC10-OH（8.6×10−4mol），用14 mL 二氯甲烷溶解，在冰水浴搅拌的条件下用注射器逐滴加入300 μL 三乙胺和300 μL 2-溴异丁酰溴，停止冰水浴，避光室温反应30 h。反应结束后，向反应液中加入少量活性炭，搅拌30 min 进行抽滤，滤饼用二氯甲烷冲洗3 遍，取滤液，用旋蒸法除去其中的二氯甲烷溶剂，得到黄色黏稠状产物。

1.3 C10-AZO-C10-PDPAn-Br 的合成

通过原子转移自由基聚合（ATRP）聚合的方法接枝聚合物。以C10-AZO-C10-OBr 作为引发剂，PMDETA作为配体，CuBr 作为催化剂，用MgSO4处理过的CH2Cl2作为溶剂，按照物质的量之比n(DPA)∶n(C10-AZOC10-OBr)∶n(CuBr)∶n(PMDETA)=m∶1∶1∶1.1（ m=30、50、80，合成3 种PDPA 链长不同的聚合物）的比例将药品分别放入Schlenk 瓶中，加6 mL 溶剂CH2Cl2。经过3 次液氮冷冻-抽真空-溶解，在冷冻、氮气保护的条件下加催化剂CuBr，于室温避光条件下反应12 h。反应结束后，通入空气，无水无氧体系被破坏，反应停止，此时溶液呈深绿色。将反应液通过装有中性氧化铝的柱子，用THF 作洗脱液除去CuBr。通过旋蒸和在冷冻的无水甲醇中沉降的方法除去溶剂以及未反应的单体DPA、配体PMDETA，收集产物，得黄色黏稠状聚合物，通过1H-NMR 以及 GPC 检测产物纯度。

1.4 C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45 的合成

首先将1.00 g mPEG45溶解在10 mL 新蒸的THF中，在冰水浴条件下，加入0.04 gNaH 并反应3 h，活化PEG 中的羟基，再加入新蒸的THF 溶解的C10-AZO-C10-PDPAn-Br，室温避光反应2.5 h。反应完全后旋蒸，无水甲醇沉降3 次，得到黄色黏稠状产物。用1H-NMR 确定产物的结构，用GPC 检测聚合物的相对分子量（Mn）和分布系数（PDI）

毛泽东同志说，正确的政治路线确定之后，干部就是决定的因素。在高等教育大变革和大发展的态势之下，地方高校怎样抓住“黄金发展期”，将改革与发展推上一个新的高度，刻不容缓地摆在了各级各类地方高校的党委面前。笔者认为从中观层面入手，就是要选好用好中层领导干部，以此为抓手，不断提升地方高校的核心竞争力。

1.5 嵌段聚合物的物性表征

1.5.1 聚合物pH 敏感点的测定 配制质量浓度为0.3 mg/mL，pH 3.0 的酸性聚合物溶液C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45（n=30,50,80）。用一定浓度的NaOH溶液调节溶液的pH，用DLS 和紫外-可见分光光度计测定溶液在不同pH 下的电位、透射率的变化，以电位或透射率值为纵坐标，pH 值为横坐标作图。

1.5.2 聚合物光敏感性的测定 配制质量浓度为0.3 mg/mL，pH 3.0 的酸性聚合物溶液C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45（n=30,50,80），置于紫外分光光度计的比色皿中，用365 nm 的紫外光每隔5 s 或10 s 照射（至曲线不再变化），然后再用470 nm 的可见光照射至曲线不再发生变化，在此过程中实时检测溶液的紫外吸收值。

以芘作为荧光探针测定聚合物在水溶液中的临界胶束浓度（CMC）。首先配制芘在水中的饱和溶液，然后把一定量的C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45（n=30,50,80）的THF溶液置于玻璃试管中，用吹风机使THF 挥发干净，然后加入2 mL 芘的饱和溶液，使聚合物芘溶液的初始质量浓度为0.2 mg/mL，接下来用芘饱和溶液不断稀释，在此过程中，设定荧光分光光度计的激发波长为334 nm，检测不同质量浓度的聚合物芘溶液在373 nm以及384 nm 处的荧光强度，以荧光强度比值（I373/I384）为纵坐标，聚合物芘溶液质量浓度的对数值为横坐标作图，其突变点即为CMC 值。

1.6 聚合物胶束的制备

使用溶剂挥发法制备聚合物胶束。首先配制6 mg/mL 的聚合物C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45（n=30,50,80）的THF 溶液，取100 μL 到棕色小瓶中，在搅拌下逐滴加入2 mL、pH 7.4 的磷酸盐缓冲溶液（PBS）（1 mmol/L），继续搅拌12 h，使溶液中的THF 挥干，得到质量浓度为0.3 mg/mL 的胶束溶液。对于载药的聚合物胶束，在把聚合物的THF 溶液转移到棕色小瓶后，加入盐酸型阿霉素（DOX·HCl）和适量三乙胺，搅拌1 h，使亲水性盐酸型阿霉素转变为疏水的DOX，以便包载在胶束的疏水核中，再逐滴加入pH 7.4 的PBS 缓冲溶液，使药物的最终质量浓度为0.5 mg/mL，继续搅拌12 h，用分子截留量为14000g/mol的透析袋透析除去未被包载的DOX。所形成聚合物胶束的粒径、电位用DLS 表征，形貌特征用TEM 表征。检测包裹在胶束中的DOX 在480 nm 处的吸收值，得到DOX的包载量（DLC）及包封率（DLE）。公式如下：

其中：mB1为胶束中的药物质量，mg；mC1为总胶束质量，mg；mC2为总药物质量，mg。

1.7 C10-AzO-C10-PDPA30-mPEG45 胶束的药物释放

把8mL 包 载 DOX 的 C10-AZO-C10-PDPA30-mPEG45胶束溶液分别取1 mL 装入6 个透析袋中，然后分别放入装有25 mL PBS 缓冲液（pH 分别为5.0、6.4、7.4）的两组离心管中，其中一组预先用365 nm的紫外光照射60 s，之后把两组离心管一起放入恒温振荡箱中振荡，每隔一定时间用紫外-可见分光光度计测定离心管中缓冲液在480 nm处的紫外吸收值，从而确定药物释放量。8 mL 中剩余的2 mL 胶束溶液加入HCl 溶液解离，用以测定胶束中包载的总药量。DOX 累计释放量以I1/I2×100%表示，其中：I1为不同时间胶束中释放出DOX 的紫外吸收强度；I2为胶束包载的总DOX 的紫外吸收强度。

1.8 细胞存活率实验

人肝癌细胞系Huh7 和人肾上皮细胞系HEK-293T 均来自于美国ATCC 细胞库，这两款细胞都在DMEM 培养液中培养，培养液中同时加入100 U/mL青霉素、100 U/mL 硫酸链霉素和10%（体积分数）FBS，并将细胞放在37 ℃、含5%（体积分数）二氧化碳的培养箱中培养。

空胶束的细胞毒性：在96 孔板上接种人肝癌细胞系Huh7 或人肾上皮细胞系HEK-293T 细胞（104个细胞/孔），培养过夜。然后加入不同质量浓度的空胶束（7.5～225 μg/mL），共孵育8 h 后换成新鲜培养液再继续培养16 h，在每个孔中加入10 μL CCK-8 中的试剂，将培养板置于培养箱中孵育1 h，然后用酶标仪检测450 nm 处的吸光度。

2 结果与讨论

2.1 嵌段聚合物的合成及表征

嵌段聚合物的合成路线如图1 所示。首先用C10-AZO-C10-OH 和2-溴异丁酰溴反应合成C10-AZOC10-OBr，然后将其作为引发剂，用ATRP 法合成聚合物C10-AZO-C10-PDPAn（n=30,50,80），最后接枝亲水性的mPEG2000，得到具有pH 和光双重敏感的两亲性聚合物C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45（n=30,50,80）。

每一步合成产物的1H-NMR 如图2 所示，图中(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ) 分 别 为C10-AZO-C10-OBr，C10-AZOC10-PDPAn和C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45的1H-NMR谱图。(Ⅰ)中a 处对应于AZO 上苯环的特征峰，b（δ=1.96）处的峰归属于Br−C−（CH3）2上的质子。(Ⅱ)中 c（δ=1.01）处的强峰归属于异丙基的甲基质子，是PDPAn的特征峰，表明了PDPAn的成功连接。(Ⅲ)中d（δ=3.63）处出现了mPEG45中重复单元−CH2CH2O−上质子的特征峰，说明mPEG45的成功修饰。综上，说明成功制备了嵌段聚合物。

图1嵌段聚合物合成路线Fig.1Synthesis route of C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45 block copolymer

图2(Ⅰ) C10-AZO-C10-OBr、(Ⅱ) C10-AZO-C10-PDPAn 和(Ⅲ) C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45 在CDCl3 中的1H-NMR 谱图Fig.21H-NMR spectra of (Ⅰ) C10-AZO-C10-OBr, (Ⅱ) C10-AZO-C10-PDPAn and (Ⅲ) C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45 in CDCl3

同时，GPC 检测结果进一步证明了嵌段聚合物的成功合成。表1 列出了合成聚合物C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45（n=30,50,80）的组成、数均分子量和分散系数（PDI）。从表1 可以看到，随着PDPA 聚合度的增加，数均分子量增大。聚合物的PDI 值偏大，可能是合成聚合物时，存在少量未反应的C10-AZO-C10-PDPAn-OBr，且不溶于无水甲醇，导致PDI 偏大。

通过测定嵌段聚合物在不同pH 环境下的透射率和电位的变化来确定pH 敏感点，结果如图3 所示。当pH<5.5 时，嵌段聚合物溶液澄清透明，透过率近乎100%；随着NaOH 溶液的滴加，PDPA 逐渐开始脱质子化，由亲水性变成疏水性，溶液逐渐变得浑浊，从而确定pH 敏感点。如图3（a）所示，pH 敏感点为6.3～7.2，且随着PDPA 聚合度的增加，嵌段聚合物的pH 敏感点略有增大。这可能是因为PDPA 链段越长，其从亲水性转变为疏水性更为困难，需要更多的OH−用以脱质子化。另一方面，随着pH 的升高，Zeta电位开始下降，这是由于在pH<5.5 时，存在大量H+，因而溶液为正电性；随着NaOH 的量逐渐增多，电位由正转为负（如图3（b）所示）。Zeta 电位的结果和透过率法测出的嵌段聚合物pH 敏感点基本一致。

表1C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45 共聚物的分子量和分散系数Table1Molecular weight and dispersity index(PDI) of C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45 copolymers

嵌段聚合物的光敏感性可以通过测定聚合物溶液在不同光照下的紫外吸收值来确定。其中偶氮苯以反式（trans-）构型存在，在350 nm 处有一个强的特征吸收峰，顺式（cis-）偶氮苯在440 nm 处有较强的吸收峰。从图4（a）、4（c）、4（e）的实验结果看出，当用365 nm 的紫外光照射0.3 mg/mL 的各聚合物C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45（n=30,50,80; pH=3）溶液时，随着光照时间的增加，350 nm 处的紫外吸收值逐渐减小，440 nm 处的峰值略有增高，反式构型的AZO 逐步向顺式构型转变，当光照时间约为20 s 以上时，紫外吸收曲线均不再发生变化，说明反式偶氮苯向顺式偶氮苯转化已达到平衡。之后再用470 nm 的可见光照射，结果如图4（b）、4（d）、4（f）所示，在350 nm左右处的吸收峰强度逐渐增强，440 nm 处的吸收峰强度逐渐减弱，顺式构型的AZO 逐步向反式构型转变。实验发现3 种聚合物在可见光分别照射5、10、35 s之后，顺式偶氮苯又向反式偶氮苯转化并且达到平衡，其中，C10-AZO-C10-PDPA30-mPEG45反异构化速度最快，表明连接较大尺寸的聚合物可能会阻碍反异构化的进行。同时，与紫外光照前相比，光照后350 nm处的吸收值有所降低，440 nm 处的吸收值略有升高，表明偶氮苯不能完全回复到紫外光照前的状态，这可能是由于PDPA 嵌段对AZO 基团的异构化具有一定的阻碍作用[33]。以上结果说明聚合物具有可逆的光敏感性。

2.2 嵌段聚合物胶束的物性

CMC 值是嵌段聚合物形成胶束最基本的物性参数。本文利用芘作为荧光探针，测得各聚合物C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45（n=30,50,80）的CMC值分别为1×10−1、1×10−2、1×10−2mg/mL（图5（a）），且随着PDPA 聚合度的增加而减小。这可能是由于PDPA 链长越长，形成胶束时疏水聚集能力越强，越容易形成胶束，因此CMC 值越小。通过DLS、TEM表征所形成胶束的粒径以及形貌，结果如图5（b）、5（c）所示，可见各聚合物形成球状且粒径分布均匀的胶束，PDPA 聚合度为30、50、80 的聚合物胶束平均直径分别在140、200、220 nm 左右。在pH=7.4 的PBS（1 mmol/L）缓冲液中，嵌段聚合物所形成胶束的平均直径随着PDPA 聚合度的增加而增大。原因可能在于PDPA 疏水嵌段越长，所形成胶束疏水内核越大，胶束直径就越大。通过TEM 所观察到的粒径大小和DLS 的测定结果基本一致。

2.3 聚合物胶束的体外模拟释药

图3不同pH 环境下聚合物胶束溶液的（a）透射率及（b）Zeta 电位的变化（聚合物胶束溶液质量浓度0.1 mg/mL）Fig.3(a) Transmittance and (b) Zeta potential of polymeric micelle solution in different pH environments(Mass concentration of copolymeric micelle solution: 0.1 mg/mL)

图4反式 (a) C10-AZO-C10-PDPA30-mPEG45, (c) C10-AZO-C10-PDPA50-mPEG45, (e) C10–AZO-C10-PDPA80-mPEG45 受到不同时间紫外光（365 nm）照射后的紫外吸收谱图; 顺式 (b) C10-AZO-C10-PDPA30-mPEG45, (d) C10-AZO-C10-PDPA50-mPEG45,(f) C10-AZO-C10-PDPA80-mPEG45 受不同时间可见光（470 nm）照射后的紫外吸收谱图Fig.4Ultraviolet absorption spectra after irradiation of ultraviolet (365 nm) after different time intervals of trans-(a) C10-AZO-C10-PDPA30-mPEG45, (c) C10-AZO-C10-PDPA50-mPEG45, (e) C10-AZO-C10-PDPA80-mPEG45; Ultraviolet absorption spectra after irradiation of visible light (470 nm) after different time intervals of cis-(b) C10-AZO-C10-PDPA30-mPEG45, (d) C10-AZO-C10-PDPA50-mPEG45,(f) C10-AZO-C10-PDPA80-mPEG45

人体正常生理环境的pH 约为7.4，肿瘤微环境为弱酸性，pH 约为6.5，肿瘤细胞内部环境的pH 更低，约为5.5～6.5[34]。本文选取了pH 敏感点为6.3 左右的嵌段聚合物C10-AZO-C10-PDPA30-mPEG45制备胶束，作为抗癌药物DOX 的载体进行体外模拟释药，载药量为12.1%±1%。

选取pH 为5.0、6.4 和7.4 这3 种pH 环境进行药物释放研究。DOX 的释药结果如图6 所示，累计释药量随着环境pH 值的降低而增大。在pH=7.4 时，25 h 后的累计释药量约为11.3%±4%，说明在人体正常生理环境下，聚合物胶束能够有效地包载DOX，药物泄漏量少。在pH=6.4 和pH=5.0 条件下，相应的DOX 最终平衡累计释药量分别约为59.6%±5%，81.0%±5%。这是因为溶液酸性越强，聚合物PDPA 嵌段越容易发生质子化，从疏水性逐渐变成亲水性嵌段，引起胶束结构动摇从而释放包裹在胶束疏水层内的DOX。

图5(a)聚合物C10-AZO-C10-PDPAn-mPEG45（n=30,50,80）的临界胶束浓度随荧光强度比值I373/I384 变化曲线（pH=7.4）；(b)聚合物胶束的粒径分布图（pH=7.4）；(c) 聚合物胶束的透射电镜图（pH=7.4）Fig.5(a) Florescence intensity ratio (I373/I384) versus logarithm of critical micelles concentrations（ C10-AZO-C10-PDPAnmPEG45（n=30,50,80））; (b) Size distribution of the copolymer micelles; (c) Transmission electron micrographs of copolymer micelles(pH=7.4)

图6聚合物C10-AZO-C10-PDPA30-mPEG45 在不同pH 和紫外光照射条件下的累计释放曲线Fig.6Accumulated release curves of C10-AZO-C10-PDPA30-mPEG45 in different pH under irradiation of UV light

同时，考察了紫外光刺激后的释药效果。在开始释药前，用365 nm 的紫外光照射各个pH 下的载药样品，发现其释药率都增加了约10%左右。这是因为部分疏水性DOX 包裹在C10-AZO-C10嵌段所形成的疏水层中，紫外光照使AZO 由反式构象变为顺式构象，导致胶束的疏水层发生扰动，促进了DOX 的释放。

2.4 聚合物C10-AZO-C10-PDPA30-mPEG45 空白胶束的细胞毒性

为了检测聚合物C10-AZO-C10-PDPA30-mPEG45胶束本身的生物相容性，分别用人肝癌细胞系Huh7和人肾上皮细胞系HEK-293T 与不同质量浓度的C10-AZO-C10-PDPA30-mPEG45胶束共孵育8 h，然后换成新鲜培养液继续孵育16 h，用细胞毒性试剂盒（CCK-8）检测细胞的存活率。实验结果如图7 所示，与不同质量浓度的空白胶束作用后这两个细胞系的细胞存活率依然很高，即使空白胶束质量浓度高达225 μg/mL，Huh7 和HEK-293T 细胞的存活率仍保持在90%以上，这说明聚合物C10-AZO-C10-PDPA30-mPEG45胶束无论是对肝癌细胞还是对正常细胞其毒性都极小，表明此聚合物胶束具有良好的生物相容性，适合作为药物载体。

图7不同质量浓度的聚合物空白胶束对Huh7 和 HEK-293T 的细胞毒性Fig.7Cytotoxicity to Huh7 and HEK-293T cells at different mass concentrations of copolymer micelle

3 结 论

（1）利用肿瘤细胞微环境的特点，设计合成了同时具有pH 响应和紫外光响应的嵌段共聚物，通过自组装过程制备pH/光可控释药载体。

（2）首先测得了各聚合物C10-AZO-C10-PDPAnmPEG45（n=30,50,80）的各项物理化学性质，其CMC 值分别1×10−1、1×10−2、1×10−2mg/mL，而 其粒径也在140～220 nm之间，满足EPR 效应的基本要求。

（3）嵌段聚合物在不同pH 环境下表现出不同的亲、疏水性，且受到聚合物嵌段长度的影响而具有不同的pH 敏感点，其敏感点在6.3～7.2 之间。

（4）通过对嵌段聚合物的紫外光响应性能考察，证实了AZO 基团的顺反结构可以在365 nm 的紫外光和470 nm 的可见光照射下发生可逆转换，照射下具有良好的光响应性能。

（5）验证了聚合物在水相中具有优良的pH/光双敏感可控性，通过照射可使原先pH 敏感的聚合物胶束的释药率提高10%左右，而细胞毒性实验表明所获得的聚合物胶束不论是在低质量浓度（7.5 μg/mL）下还是在较高质量浓度（225 μg/mL）下都有较高的生物相容性，可以预见该pH/光双敏感的聚合物胶束在靶向药物载体研制领域具有良好的应用前景。