延龄草多糖研究进展

付晓云，张红燕

(昆明医科大学药学院暨云南省天然药物药理重点实验室，云南 昆明 650500)

1 延龄草概述

1.1 分类及地位

延龄草(Trillium tschonoskii Maxim)，百合科延龄草属多年生草本植物, 别名头顶一颗珠。其味甘，性平，有小毒，以干燥根和根茎入药(俗称“地珠”)，或以干燥果实入药(俗称“天珠”)，有镇静安神，活血止血，延年益寿的功效，主治外伤出血，头晕目眩，跌打损伤等[1]。延龄草属植物主产于北美，亚洲东部，其中北美有38种，亚洲有11种，我国有3种，包括延龄草(Trillium tschonoskii Maxim)，吉 林 延 龄 草(Tril-lium kamtschaticum Pall.ex Purch)与西藏延龄草(Trilli-um govanianum Wall.ex Ruyle)，主要分布在西北、东北和西南地区[2-3]。该属植物为少常用中药，历代本草中鲜有记载，主要在我国土家族和苗族地区应用较为广泛，且疗效确切[4]。

1.2 化学成份

查阅文献报到，延龄草属植物的次生代谢主要以皂苷为主，主要为甾体皂苷，按结构特点可分为I-V类，同时还有黄酮苷、倍半萜苷、苯丙素苷等类型的化合物[5]；除此之外，还有鞣质类、腺苷类和多糖类等活性物质[19]。总体来说，国内外对延龄草的研究较少，尤其是关于多糖类活性成份。

1.3 资源与利用状况

由于环境因素、人为因素，加之该属植物种子休眠期长，发芽率低等自身的生物学特性，延龄草种属数量急剧下降，曾被列为国家医药管理局管理的二类药材，国家三级保护植物[5-7]。随着张国华等[8]开发的延龄草栽培技术，近些年开始了人工种植，资源相对有所提升，对其的研究也越来越深入。

2 延龄草多糖概述

多糖是由10个或10个以上的单糖通过糖苷键连接形成的含醛基或酮基的天然高分子聚合物，广泛存在于动物、植物、微生物中。多糖作为生命物质的组成成分之一，它广泛参与了细胞的各种生命现象及生理过程的调节。具有提高免疫，降血糖，抗肿瘤，抗病毒等多种生物活性，被认为是构成生命的四大基本物质之一，是一项很有前景的天然药物[15-17]。

2.1 延龄草多糖的提取分离

2.1.1 材料预处理

多糖在植物、动物和微生物中均有广泛分布。不同植物，动物和微生物的器官和组成千差万别，多糖提取时，根据不同的生物体，选择不同的预处理方法。在动物类和植物种子中，由于含有大量的蛋白质和脂类，提取前一般先用石油醚脱脂或用酶解法除蛋白质；植物地上部分因含有大量的叶绿素，提取多糖时，应依次使用石油醚、丙酮、乙酸乙酯和乙醇进行脱色素处理；植物的地下根茎中，含有大量的淀粉，在多糖提取前或者提取过程中，应去除植物中所含的淀粉，以免影响多糖的性质和得率[19]。高晰等[20]采用10倍量甲醇，回流提取两次，每次2 h，以去除药材中的单糖、低聚糖、色素和其他脂溶性成分，同时消灭酶活性以防止酶对多糖的降解。

2.1.2 延龄草多糖的提取

多糖在自然界中分布较广，组成复杂，其提取、分离方法也各不相同。多糖的提取、分离、纯化，必须根据多糖的理化性质、分子量，选择合适的方法进行。多糖的提取方法主要有传统的提取方法如渗漉法、浸渍法、煎煮法、回流提取法和较现代的提取方法：超声波提取法、超临界提取法、酶提取法等。在传统的提取方法中，其中渗漉法和浸渍法属于冷提法，适用于对热不稳定或易被破坏成分的提取。根据文献调查，延龄草多糖的提取方法主要采用热水浸提法：徐静静等[21]采用正交设计优化延龄草多糖的热水浸提工艺，其结果是：在最佳提取工艺下，延龄草多糖的提取率为6.75%；高晰等[20]采用水提醇沉工艺提取延龄草多糖，其结果是：在最佳提取条件下，延龄草多糖的得率为4.96%；周浓等[24]应用正交设计，研究比较回流提取法、热水浸提法和超声提取法，结果表明：回流提取法在最优条件下多糖的提取率可达18.72 mg/g；热水浸提在最优条件下多糖的提取率可达23.84 mg/g；超声波提取法在最优条件下多糖的提取率可达24.32 mg/g。总的来说，延龄草多糖的提取率为5%左右，较多采用回流提取法。

2.2 延龄草多糖的纯化

经水提醇沉得到的粗多糖成分复杂，不仅包含着分子量不同的多糖成分，而且还包含着蛋白质，色素，无机盐等物质。故在多糖的纯化过程中，要利用有效的手段去除粗多糖中的杂质成分。蛋白质和多糖同属强极性生物大分子，多糖提取液中含有蛋白质是一个普遍现象，因此，去蛋白是多糖分离的一个重要过程。植物多糖中游离的蛋白多采用Sevag法，三氯乙酸法和三氟三氯乙烷法，结合蛋白多采用酶解法[25-26]。但目前对延龄草多糖的纯化报导较少，只有对同属植物重楼多糖的研究报导。申世安等[19]采用Sevag法研究了重楼多糖中蛋白质的去除，其最佳次数为3次，此时蛋白质的去除率为74.47%，多糖的损失率为20.88%。

除蛋白后的延龄草多糖仍为复杂的混合物，需要对其进一步的分离纯化。目前，植物多糖的纯化常使用不同类型的DEAE-离子交换色谱和葡聚糖凝胶色谱联合使用。申世安等[19]采用DEAE-52色谱柱进行分离滇重楼多糖后，采用SephadexG-100色谱柱反复分离纯化，并用HPLC上检测纯度。韩晓强等[27]采用DEAE-52离子交换柱色谱分离五种云南野生食用真菌多糖，之后用不同孔径的凝胶柱(SephadexG-200、SephadexG-150、SephadexG-100)进行分离纯化，经纯度检测最终分离得到了六个均一的多糖。吴向美等[28]也使用同样的方法纯化肉苁蓉多糖，分离得到17个均一多糖。综上表明，使用不同类型的DEAE-离子交换色谱柱和葡聚糖凝胶色谱联用法适合植物多糖的纯化，为延龄草多糖的纯化提供了参考。而小分子物质、色素、无机盐等大多采用透析法。

2.3 延龄草多糖的含量测定

多糖的含量测定方法主要有比色法：硫酸-咔唑比色法、苯酚硫酸比色法、蒽酮-硫酸比色法、间羟基联苯比色法、3,5-二硝基比色法等；色谱法：气相色谱(GC)法和高效液相色谱(HPLC)法；红外光谱定量分析多糖方法和紫外分光光度法；此外还有一些新型的测定方法：共振光散射法(RLS)法和生物传感器法等。何佩娟等[29]综述了多糖含量测定的各种方法，指出在多糖的测定中，比色法的应用较为广泛。一般常用苯酚硫酸比色法、蒽酮-硫酸比色法，两种方法均有灵敏度高，结果较为准确的优点，但都操作复杂、步骤多且繁琐、只能测定多糖总含量，若存在单糖会对结果产生巨大影响。二硝基水杨酸法操作简便、快速、灵敏度高，在多糖含量的测定中常被应用。光谱法具有操作简单，灵敏度和准确度均相对较高的优点，但对仪器设备有要求。目前，延龄草多糖的含量测定方法主要使用苯酚硫酸比色法。罗利方等[30]优化了苯酚-硫酸法测延龄草多糖含量，其中苯酚的浓度为5%，用量为1 mL，硫酸用量为6 mL，水浴温度为沸水浴，水浴时间25 min，用常温冷却法冷却。其经测定了三批南江县产延龄草多糖的含量，测得延龄草中多糖的含量高达47.98%。为保证延龄草多糖稳定、安全和有效用药提供了数据。

2.4 延龄草多糖的结构鉴定

多糖的结构鉴定需要解决单糖的构型、单糖的组成(单糖的种类和比例)、糖与糖的连接位置和顺序。

2.4.1 延龄草多糖纯度和分子量的确定

研究样品在进行分析之前，必须对样品进行纯度分析。多糖是大分子聚合物，即使是纯品，其微观也不均一，仅代表相似链长的多糖分子的平均分布，即一定相对分子质量范围内的多糖的平均分布。测定多糖分子量的方法有凝胶色谱法、电泳法、超速离心法、旋光度法、渗透压法以及联用技术等。中药多糖主要测定数均分子量和重均分子量，目前常用体积排阻色谱法(包括凝胶渗透色谱法和高效凝胶渗透色谱法)。2005年版《中国药典》Ⅱ部中收载了用高效凝胶渗透色谱法测定多糖分子量和分子量分布方法[31]。秦建鲜等[32]也综述了中药多糖相对分子质量测定方法，简要的归纳分析了各方法的优缺点并进行了对比，筛选出了简单实用的多糖相对分子质量测定方法为高效凝胶渗透色谱法，该方法操作简单、快速、灵敏、重复性好和样品用量少，为测定多糖相对分子量及分子分布的首选方法。金有权等[33]用高效凝胶色谱法分析了绣球花多糖，结果为4个组分多糖样品的平均分子量分别为1.49×105、1.25×105、1.01×105、1.37×105。

2.4.2 单糖的组成分析

单糖的组成主要采用完全酸水解法，常用的酸有三氟乙酸、适当浓度的硫酸、盐酸等。水解产物可以用纸色谱或者薄层色谱来初步分析样品是否被完全水解以及得到初步的单糖组成信息，然后根据实际情况选择合适的方法对单糖的组成进行定量和分析。罗利方等[30]采用柱前衍生化HPLC法分析了延龄草多糖中单糖的组成，结果表明延龄草多糖主要是由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖组成，其摩尔比1.17:2.56:1.53:98.59:1.99:1.0:18.84，但仍有四个单糖未被指认。研究表明延龄草多糖中主要的单糖为葡萄糖，含量高达36.89%，占总糖的76.88%。多糖中单糖的组成是研究多糖构型的重要前提，单糖的连接顺序和构型等还未有文献报导，而单糖的连接方式主要使用IR、NMR和甲基化等方法。唐韵等[34]通过热水提取并通过Millipore(100 kD)和Sephadex G-200纯化从梅叶鳞草获得多糖，用苯酚-硫酸法测得多糖含量为89.9%，高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)估计其平均分子量为2.213×106 Da。单糖分析表明，多糖由阿拉伯糖，甘露糖，葡萄糖和半乳糖组成，摩尔比为2.134:1:2.78:2.82。经过Smith降解，甲基化，红外光谱和NMR后，鉴定了多糖的一级结构。

2.5 延龄草多糖的生物活性研究

20世纪70年代人们发现了真菌多糖[35]具有抗癌活性，自此人们对多糖的生物活性有了高度重视，现从中草药和食用菌中分离得到的多糖已有数百种，其中为植物多糖最多。由于多糖结构的多样性和复杂性，多糖具有多种多样的得药理活性。大量的药理学和临床医学表明，植物多糖具有免疫调节，抗肿瘤，降血脂，抗病毒等功能，且对正常细胞无毒副作用。王益富等[14]探讨了百花延龄草水提液对肝纤维化作用和作用机制，经腹腔注射四氯化碳构建雄性C57鼠肝纤维化模型，给药百花延龄草水提液0.5 g/kg、1 g/kg，阳性对照为扶正化瘀胶囊(0.75 g/kg),经生化实验表明给药组和阳性对照组均能显著抑制 CCl4 诱导的小鼠肝纤维化程度，与模型组相比，给药组和阳性对照组血清 ALT(丙氨酸氨基转移酶)，AST(天门冬酸氨基转移酶)水平及肝脏组织中 MDA(丙二醛)水平明显降低(P<0.01)，SOD 显著提高(P<0.01); 与模型组相比，给药组和阳性对照组TGF-β 蛋白表达具有显著的抑制作用(P<0.01),表明了白花延龄草水提液对肝纤维化有显著的改善作用；孙艳平等[12]研究了延龄草水提液对小鼠镇静催眠作用：主要通过小鼠直接睡眠法、自主活动能力测定实验、与阈下剂量及阈上剂量的戊巴比妥钠协同睡眠等实验方法，结果表明延龄草提取物能减少小鼠自主活动能力和行为，增加由阈下剂量及阈上剂量戊巴比妥钠诱导的小鼠入睡百分率和睡眠时间，说明了延龄草提取物对小鼠有一定镇静催眠作用。目前，关于延龄草多糖明确的生物活性尚未报导。

3 结 语

延龄草生长环境、加工、提取纯化方法的不同，导致多糖含量、分子量、单糖组成及摩尔比、连接位置及顺序存有一定差异，从而影响多糖的生物活性的强弱。目前，延龄草多糖的提取研究较少，主要还是采用传统的热水浸提法，在此基础上借助超声和酶辅助提取，一定程度上提高了多糖的提取率，但对于延龄草多糖的工业化提取方法仍比较落后粗放。延龄草多糖分离纯化过程主要包括脱蛋白、脱色和不同多糖组分之间的分离，但对此方面的研究还未有报导，之后可以考虑借鉴其它多糖纯化的新途径、新思路，如膜分离技术，膜分离与柱色谱联合，以便更高效地获取精制的延龄草多糖，分离纯化后延龄草多糖的分子量、单糖组成研究比较也比较少且不完善，还需进一步深入研究。因此，关于延龄草多糖的研究可以从提取工艺的优化、新型技术在结构分析和含量测定中的使用等出发，开发出提取率高、含量稳定的延龄草多糖提取工艺和结构确定、疗效确切的分析方法，并且探索出一套可控制其质量的质量控制方法，实现工业化生产，使其能成为安全、稳定、有效和质量可控的保健食品和药品原料。