免疫传感器芯片表面的抗体固定化方法*

李 静, 崔传金, 龚瑞昆, 王春皓, 邵 斌

(华北理工大学 电气工程学院，河北 唐山 063210)

0 引 言

免疫传感器作为一种新兴的传感器，将传统的免疫测试和传感器技术融为一体，集两者的诸多优点于一身，不仅减少了分析时间，而且提高了灵敏度和测试精度。免疫传感器的检测灵敏度取决于捕获抗体如何固定在表面密度低的固体载体上，抗体作为免疫传感器最主要的识别元件，选择亲和力好、稳定性高的抗体不仅能使它们的抗原捕获潜力最大化而且能够提高传感器的性能[1,2]。

抗体是介导体液免疫的重要效应分子，能够特异性结合相应抗原的免疫球蛋白。抗体由两个抗原结合区域(Fab)和一个可结晶区域(Fc)组成。两个Fab片段由铰链区域的二硫键连接形成的F (ab’)2片段。铰链区含有大量的脯氨酸，因此容易伸展和弯曲。Fab区域在氨基酸组成、等电点和物理结构上都与抗体Fc区域不同，从而可以确定抗体在表面上的取向[3]。理想情况下，固定化抗体的Fc片段面向传感器表面，然而随机固定的抗体可能以各种方式散落在表面孔道，不仅造成部分抗体的失活，还会降低传感器灵敏度。

在固体表面有效的固定抗体是包括免疫测定和生物传感器在内的各个领域的重要课题。然而，没有一种抗体固定方法是普遍适用的，都需要将固相载体和抗体自身的性质来结合起来进行选择。

1 物理吸附

物理吸附是溶质与吸附剂之间由于分子间力而产生的吸附，是最早抗体固定化方法。因其操作简单，固定化酶活力较高而被广泛应用。但是由于物理吸附没有选择性，抗体并不固定在固体表面的特定位置上，酶和载体结合不牢固，在使用过程中容易脱落，常与交联剂使用。Zhang Z等人[4]采用直接吸附法构建了用于邻苯二酚检测的免疫传感器，在优化的条件下，该传感器的电化学响应是线性的，邻苯二酚的浓度范围从0.5～300.0 mm。王存嫦等人[5]结合自组装单分子膜(SAMs)和聚电介质静电吸附组装技术，通过静电吸附作用固定抗体，实现了对相应抗原的检测。

2 共价耦合

2.1 氨基、羧基耦合

化学偶联方法可以减小抗体固定过程的随机性并增强固定抗体的稳定性。但是基于氨基(NH2)和羧基(COOH)的抗体固定随机性较强，有时在Fab片段抗原结合区域附近会有反应性较强的NH2或COOH，此时通过NH2或COOH的固定方式容易造成抗体的失活。

Alizadehzeinabad H等人[6]将抗体的COOH端与2—巯基乙胺SAM上的NH2端共价结合，实现抗体在金叉指电极上的定向固定。该免疫传感器的线性范围为5 pg/mL～1 ng/mL，检出限为1.34 pg/mL，信噪比为3；Roxana J J等人[7]利用聚乙烯亚胺的NH2与大肠杆菌抗体的COOH进行偶联，实现了抗体与芘—聚乙二醇修饰的金电极连接，构建了检测尿致病性大肠杆菌UTI89细菌的免疫传感器，其线性检测范围为1 101～1 104 cfu/mL，检出限为10 cfu/mL；Seenivasan R等人[8]利用共价键结合将抗体固定在氨化的金纳米颗粒溶液修饰的氧化铟锡阵列电极表面，构建了检测癌细胞的免疫传感器。该传感器实现了快速准确检测微量样品中癌细胞的数目。检测时间不超过6 min，检测范围25～300 cell/20 μL，检测的重现性达97 %。

2.2 硫醇基

金硫醇键的开发使得这种固定化方法在表面等离子体共振(SPR)等技术中对金衬底和纳米颗粒非常有用，根据光子固定化技术的方法，紫外线激发也被用于在抗体的铰链区域启动二硫键的光还原。利用258 nm和10 kHz的紫外脉冲，可以产生自由硫醇，然后可以结合金衬底进行石英晶体微平衡测量[9]。Korean J等人[10]将2—亚氨基硫代烷与蛋白质的初级胺发生反应，引入SH基团，同时保持与原始NH2类似的电荷性质。通过硫代反应，可以将包括抗体在内的目标生物分子直接有效地固定在金表面；Xu M等人[11]基于硫醇—金相互作用将硫代抗体固定在纳米金表面。基于硫代抗体的免疫传感器在大肠杆菌污染的河流和自来水样品中检出限为10 cfu/mL，检测时间为1 h，获得了更好的性能。

2.3 通过糖基部分的偶联

利用抗体Fc部分的一个独特的碳水化合物部分是另一种共价固定方法。Ho J A等人[12]利用硼酸与生物素抗体的碳水化合物单元相互作用，将抗体固定在硼酸修饰的丝网印刷石墨电极上，构建了检测生物素的免疫传感器，该传感器最大化地增加了表位密度，检出限为0.19 pg；Liu Y S等人[13]利用共聚物刷(3D和灵活性)和硼酸的优点，通过Fc端碳水化合物与环硼酸酯结合定向固定抗体，使抗体结合位点充分暴露，从而提高了抗体抗原的结合效率；Zhao J等人[14]将两性离子磺甜菜与甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)共聚物固定在惰性聚丙烯上，硼酸基团通过与活性GMA单元共价结合，对抗体进行定向固定。硼酸基团在聚合物刷中能够促进抗体定向固定，所以抗体的生物活性得到很好的保存，使表面抗原结合能力显著增强。

3 亲和作用

3.1 生物素—亲和素

生物素通常从卵黄和肝组织中提取。亲和素可由蛋清提取，是一种由4个相同亚基组成的糖蛋白。使用较多的是从链霉菌中提取的链霉亲和素，链霉亲和素的4个生物素结合位点两两靠近，这使得链霉亲和素可以作为桥连分子，将生物素化的抗体与固相连接起来[15]。利用生物素—亲和素之间的亲和作用，可以提高抗体抗原的结合能力，但是该方法需预先包被，对抗体生物素化。

Li Y等人[16]将大肠杆菌O157∶H7和霍乱弧菌的生物素化抗体连接到涂有链霉亲和素的磁珠上，通过抗体抗原相互作用原理捕获功能化检测抗体，构建了能同时测定大肠杆菌O157∶H7和霍乱弧菌的免疫传感器，其检出限分别为39 cfu/mL和32 cfu/mL；Sun X C等人[17]在金膜上对大肠杆菌O157∶H7进行免疫磁珠标记免疫分析，采用双抗体夹心免疫法和链霉亲和素—生物素结合法将纳米磁珠固定在二抗上，构建了检测大肠杆菌的免疫传感器，其检出限为100 cfu/mL；Ma X等人[18]将生物素标记的抗体固定在牛血清白蛋白和亲和素修饰的玻璃碳膜载体上，通过碱性磷酸酶标记的糖基多糖—3(GCP3)与抗体结合，构建了检测GPC3的免疫传感器，检出限为0.2 ng/mL。

3.2 蛋白质A或蛋白质G法

蛋白A包含四个特定于抗体Fc区域的结合位点，可以与许多哺乳动物的免疫球蛋白Fc区域特异性结合，同时使Fab区域用于抗原结合。这种生物功能化方法可以实现抗体的定向固定化，使结合位点暴露于包含待检测目标分析物的样本溶液中，从而最大限度地与它们进行相互作用，而且相对于随机固定，固体载体上定向固定蛋白A增强了抗体结合能力[19]。Miyaoa H等人[20]将生物素羧基载体蛋白(BCCP)融合到蛋白A的IgG结合域，通过BCCP与生物素蛋白连接酶(BPL)的络合作用，将融合蛋白固定在传感器芯片的BPL修饰金表面，蛋白A与抗体的结合使抗体固定在IgG结合域层，且固定化的抗体具有较高的抗原结合能力；Shantai L B等人[21]将蛋白A共价固定在功能化的硅晶片表面，通过蛋白A识别抗体实现了布鲁氏菌抗体的定向固定，构建了检测布鲁氏菌的免疫传感器，该传感器检测布鲁氏菌的效率是随机固定抗布鲁氏菌抗体传感器的3倍，检出限为1×106cfu/mL。

蛋白G在许多免疫检测中被广泛用于固定不同类型的抗体，该蛋白能够特异性地结合抗体的Fc区域实现抗体的定向固定，从而使抗原结合位点最佳地暴露于检测溶液中。此外，蛋白G介导的抗体固定化通常不需要任何抗体修饰。Huo X H等人[22]在交联剂EDC/NHS的作用下将蛋白G与复合材料的壳聚糖结合，加入一抗与蛋白质G结合定向固定，甲胎蛋白(AFP)与一抗结合，标记的二抗与AFP结合进行固定，构建了检测AFP的免疫传感器，该传感器线性范围宽，检出限为1.5 pg/mL；Centi S等人[23]利用EDC/NHS将蛋白质G偶联到聚乙二醇修饰的金属纳米棒表面，蛋白质G和抗体结合实现抗体的定向固定。

3.3 DNA定向引导法

DNA定向蛋白固定化是一种通过序列特异性杂交在表面固定蛋白DNA偶联物的有效方法，可以为固定化抗体提供有序的定向。该方法提高了抗原的结合能力，但需预先包被，将寡核苷酸链偶联至抗体。

Hu W P等人[24]将双链DNA(DsDNA)通过NH2与乙二醇(OEG)活化出的COOH共价偶联固定在混合的OEG/COOH-OEG SAM上，然后用NaOH使固定的DsDNA去杂交，经去离子水洗涤得到单链DNA，最后与抗体结合的互补单链杂交固定抗体；Kimura T等人[25]合成了一个温度响应表面，通过DNA双链结构固定抗体，选择性捕获和释放靶细胞；Seymour E等人[26]利用DNA偶联抗体，使用单粒子干涉反射成像传感器快速灵敏地检测整个病毒，特定的DNA序列通过共价键将每一个抗体进行编码，抗体—DNA结合物通过序列特异性杂交固定在传感器表面互补的单链DNA探针上，增强了对病毒病原体的检测。

3.4 Fc结合肽和适配体

针对抗体Fc结构域的短肽被用来促进定向固定。Tsai C W等人[27]证明分子动力学可用于设计短肽，对小鼠IgG 2a抗人前列腺特异性抗原(PSA)抗体具有较高的特异性，通过SPR监测PSA结合，表明其具有良好的抗体定位。

Tang J B等人[28]利用免疫球蛋白G结合蛋白(ZZ蛋白)和聚苯乙烯结合肽(PS-tag)形成的的融合蛋白，并通过PS-tag与亲水性聚苯乙烯的相互作用将ZZ蛋白固定在PS上，然后ZZ蛋与Fc片段相互作用实现抗体的定向固定。与被动固定化的ZZ蛋白相比，ZZ-PS标记的灵敏度提高了10倍，线性范围也更宽；Lee Y等人[29]开发了在大肠杆菌中表达的光活化Fc特异性抗体结合蛋白(FcBPs)，该蛋白在紫外线照射下与抗体发生光交联。将FcBPs固定在马来酰亚胺包覆的载玻片上，表皮生长因子受体(EGFR)-hmAb抗体与紫外线照射交联。剂量依赖性抗原结合在110 fmol以上；Ma J等人[30]设计了一种DNA适配体，能够结合多个小鼠子类的Fc结构域。该领域具有开发通用Fc结合底物适配体的潜力，从而提高抗体定位和免疫诊断敏感性。

3.5 金属亲和层析

最简单的方法是利用抗体的内源性金属结合特性。除了用于金属配位的重组肽标记外，还利用金属亲和纯化了天然无标记IgG。利用组氨酸和半胱氨酸与金属，特别是铜和锌的相互作用，利用固定化金属亲和层析技术对蛋白质进行分离纯化。

Chen H等人[31]利用PBA将NiO修饰的单壁纳米管(NiO-SWNTs)堆积在金芯片上，通过NiO与组氨酸标记物之间的螯合作用，定向地将组氨酸标记的单克隆抗体固定在NiO-SWNTs上，构建的免疫传感器的检出限为0.1 ng/mL；Welch N G等人[32]利用传统的低污染二甘醇二甲醚等离子体聚合物(DGPP)作为结合[Cr(OH)6]3—的底物，然后进行抗体固定，将大量的抗体固定在DGPP和铬功能化DGPP底物上，观察到铬功能化收缩期ELISA信号强度提高了10倍。Welch N G等人[33]也通过改变金属盐和缓冲基化合物以及比例来优化络合物，采用优化的复合物(六水合高氯酸铬对乙二胺的比例为1∶1)，相对于未处理平板，提高了牛肿瘤坏死因子ELISA 抗原检测限一个数量级。

4 重组抗体的固定

重组抗体(rAb)具有低分子量、易于捕获抗原等优点，是天然重组抗体的潜在替代品。而针对完整抗体开发的基于Fc结构域或碳水化合物部分定向固定化方法，并不能用于rAb或抗体片段，如单链抗体(scAb)或单链抗体可变区基因片段(scFv)。为了保证scFv或scAb在不变性的情况下更容易地固定在传感器表面上，人们开发了多种方法来固定它们。抗体片段可以被设计成在肽连接物中含有带正电荷的氨基酸(如精氨酸)，或者在羧基端有一个6—组氨酸氨基酸序列，分别通过静电和非共价相互作用来固定。生物亲和方法也可以将scFv固定在链霉亲和素包被的表面上，方法是通过scFv上的游离胺与生物素结合的高特异性使得利用单一的rAb来检测抗原成为可能，从而消除了对第二种抗原的特异性抗体的需要。由于rAb的体积小，免疫传感器不能被激活，也不能在高密度的环境下工作，因此提高了测定的准确性、灵敏度和稳定性[1]。

5 结 论

抗体的固定要在理想状态下。首先，要保持抗体的自然状态，不对抗体进行蛋白标记；其次，固定抗体的基片要表面均匀一致、无毒、生物兼容性好、制备简单和价格便宜；最后，抗体固定在芯片上要达到排列均匀，且固定点位方向一致，即要达到高密度的均匀一致的定向固定。随着基因工程、免疫学和纳米技术的发展，发现新抗体或抗体Fc片段上能参加固定反应的特异性强的新基团或位点，是进一步提高抗体定向固定的基础，如具有单一抗原结合域的骆驼双目抗体因其高溶解度和稳定性而备受关注。其次，根据抗体结合点位的特点和性质发现和选取合适的“固定底物”是抗体定向固定的又一个重要方面，如选取分子量更小的多肽和适配体，能提高抗体的固定密度。再次，表面均匀的新型纳米材料基片可能会极大地促进“固定底物”的固定密度和牢固程度，间接提高抗体的固定密度，如金属有机骨架等新型纳米材料。最后，抗体的定向固定是个复杂的综合过程，需要根据特定的抗体，进行技术方法的创新、获取的完备固定工艺是抗体定向固定的关键。