不同正畸力对大鼠牙周组织压力侧辅助性T细胞17相关因子表达变化的影响

王璐瑶 汪波 丛蓓蓓 崔涛 杜雨晴 宋宇

1.青岛大学口腔医学院，青岛266003；2.安徽医科大学第二附属医院，合肥230601；3.青岛大学附属青岛市口腔医院中心实验室，青岛266001；4.青岛大学附属青岛市口腔医院正畸科，青岛266001

“骨免疫学”中认为，骨改建细胞与免疫细胞间存在复杂的相互作用，通过许多共有调节分子如细胞因子、转录因子、信号分子和膜受体等密切相关[1]。在正畸牙移动过程中，牙周组织在机械力作用下介导的免疫反应可能会诱导T 细胞活化，从而产生一种刺激性反应引起骨吸收[2]。其中，T细胞中最具破骨作用的是辅助性T 细胞17（T helper cell 17，Th17）[3]，能释放多种分子形成适于组织吸收的微环境，参与牙周组织改建。

目前对于Th17 细胞在口腔领域的研究大多集中于牙周病、自身免疫性黏膜病、根尖周病等，对于其在正畸牙移动中的研究甚少，在不同正畸力不同时间作用下的含量变化规律，目前鲜有报道。本文通过在大鼠正畸牙上施加不同的力，观察不同时间下压力侧牙周组织中Th17 细胞特征性转录因子维甲酸相关孤儿受体γt（retinoid related orphan receptor γt，RORγt）及其相关细胞因子白细胞介素（interleukin，IL）-17的表达量，以及骨保护素（osteoprotegerin，OPG）表达量、破骨细胞（osteoclast，OC）数量的变化规律，从分子、基因水平上初步探究不同正畸力作用下Th17 细胞对牙槽骨改建的影响，为以Th17 细胞免疫介导的正畸加力后牙周组织改建机制提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物的选择及分组 SPF 级8～10 周龄（220±10）g 雄性大鼠108 只，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，许可证号SCXK（鲁）2014 0007。本研究已经青岛大学附属医院动物伦理委员会审批通过，动物处置符合动物伦理学要求。

将其随机均分为0、50、100 g 三组[4-5]，每组36 只，每组再 分为加力0、1、3、5、7、14 d亚组。

1.1.2 主要试剂 TB Green®Premix Ex Taq™Ⅱ试剂盒（TaKaRa公司，日本）；RORγt以及内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶抗体（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）的聚合酶链反应（poly‐merase chain reaction，PCR）引物（上海生物工程股份有限公司），引物序列见表1；鼠IL-17酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（武汉市伊莱瑞特生物科技有限公司）；兔抗鼠RORγt 多克隆抗体（北京市博奥森生物技术有限公司）；兔抗鼠OPG多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的二抗（武汉市赛维尔生物科技有限公司）；兔抗鼠抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）多克隆抗体（Boster公司，美国）。

表1 PCR引物序列Tab 1 PCR primer sequence

1.2 方法

1.2.1 构建大鼠正畸牙移动模型（图1） 以上切牙为支抗，用结扎丝在上颌第一磨牙上固定镍钛拉簧。建模后所有大鼠喂养软食；每天检查装置，若松动脱落则重新固定；生理盐水冲洗大鼠口腔，防止装置处食物残渣堆积导致牙龈炎症。

图1 正畸牙移动模型Fig 1 Orthodontic tooth movement model

1.2.2 标本采集 于加力0、1、3、5、7、14 d 后，每组各处死6只大鼠，取双侧上颌第一磨牙及其牙周组织，一侧组织用于实时定量PCR（real time quantitative PCR，Q-PCR）和ELISA 检测；另一侧组织用于免疫组织化学染色法（immunohistochem‐istry，IHC）检测。

1.2.3 Q-PCR 法检测RORγt mRNA 表达量 Trizol法提取Total RNA，经逆转录后，采用TB Green嵌合荧光法，以GAPDH为内参，进行PCR反应，反应条件为95 ℃30 s、95 ℃5 s、60 ℃30 s，40 个循环。采用2-△△C(t)法对数据进行相对定量分析。

1.2.4 ELISA 检测牙周组织中IL-17 蛋白的表达量按试剂盒说明书操作，利用标准品制作标准曲线，酶标仪测出样本波长450 nm 下的光密度值（opti‐cal density，OD）值，每个标准品的平均光密度值（mean optical density，MOD）减去空白孔的OD值作为矫正值，分别代入方程计算IL-17蛋白表达量。

1.2.5 组织学标本制作及苏木精-伊红（hematoxy‐lin-eosin staining，HE）染色 组织经固定、脱钙、脱水、包埋后，制作上颌第一磨牙近远中垂直向切片，厚度5 μm，烤片2 h，常规HE染色。

1.2.6 IHC检测RORγt、OPG蛋白表达量以及TRAP阳性OC数量 采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法（streptavidin-perosidase，SP）法进行染色，抗体工作浓度分别为RORγt（1∶600）、OPG（1∶200）、TRAP（1∶200），阴性对照用磷酸缓冲盐溶液代替一抗。

采图：胞核蓝染，阳性表达为棕黄色颗粒。胞核≥3 个的TRAP 阳性细胞为OC。在400 倍光镜下，观察上颌第一磨牙近中颊根压力侧根尖1/3 以上区域，随机选取5 个视野，应用Image-ProPlus 6.0 软 件进 行RORγt、OPG 的MOD 测量 以 及OC计数。

1.3 统计学分析

使用SPSS 23.0 软件进行统计分析，数据采用均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD 法，检验水准α＝0.05，P＜0.05时差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠正畸牙移动模型成功建立

2.1.1 牙齿移动情况 50 g 组在0～1 d 发生瞬时移动，1～5 d 缓慢移动，5～7 d 加速移动，7～14 d 缓慢移动；100 g 组在0～1 d 发生瞬时移动，1～3 d 缓慢移动，3～14 d 加速移动。0 g 组0～14 d 无移动，50 g 和100 g 组1～14 d 时 均 较0 g 组有明显移 动，100 g 组在1、5、14 d 移动量显著高于50 g 组（P＜0.05）（图2、3）。

图2 0、50、100 g组第14 d牙齿移动情况Fig 2 Tooth movement of 0,50 and 100 g group on the 14 th day

图3 各组牙齿移动距离变化趋势Fig 3 Trend of tooth movement distance in each group

2.1.2 HE 染色结果 0 g 组0～14 d 时两侧牙周膜间隙等宽，纤维排列规则（图4）。50 g 组5～7 d 时压力侧牙槽骨边缘见大量OC 及骨吸收陷窝，张力侧纤维疏松，大量成骨细胞（osteoblast，OB）沿骨表面呈链状排列，第5 d 时表现最为显著；14 d 时牙周膜间隙趋于恢复，OC、OB 均较之前明显减少，张力侧大量新骨形成，在加力中后期偶见轻微牙骨质吸收（图5）。

图4 0 g组牙周组织HE染色结果 ×400Fig 4 HE staining of periodontal tissue in 0 g group ×400

100 g 组5～7 d 时压力侧见大范围玻璃样变区，牙槽骨边缘明显骨吸收及远处出现潜掘性吸收，张力侧牙周膜断裂严重，OB 增多，7 d 时表现最为显著；14 d 时压力侧潜掘性吸收明显，张力侧新骨形成不明显，牙周受损严重，在加力初期即开始有明显的牙骨质甚至牙本质的吸收（图6）。

2.2 Q-PCR 法 检 测 牙 周 组 织 中RORγt mRNA 的表达

50 g 组和100 g 组RORγt mRNA 表达量均随加力时间呈先升高后降低趋势，峰值分别位于5、7 d，50 g 组于14 d 可恢复至基线水平，而100 g 组仍维持较高水平（图7）。

同一天数下不同力值组的比较：组间比较显示，3 组之间在0、1 d 的差异无统计学意义（F值分别为0.045、2.159，P＞0.05）；3、5、7、14 d 的差异均有统计学意义（F值分别为17.604、48.185、77.660、40.647，P＜0.05）。50 g 组RORγt mRNA表达量在3～7 d 显著高于0 g 组，100 g 组RORγt mRNA 表达量在3～14 d 显著高于0 g、50 g 组（P＜0.05）。

同一力值下不同天数的比较：0 g 组不同天数间的差异无统计学意义（F值为0.727，P＞0.05）；50 g、100 g组间的差异均有统计学意义（F值分别为26.278、50.141，P＜0.05）。50 g组RORγt mRNA表达量在3～7 d 高于0 d，100 g 组RORγt mRNA 表达量在3～14 d高于0 d（P＜0.05）。

图5 50 g组牙周组织HE染色结果 ×400Fig 5 HE staining of periodontal tissue in 50 g group ×400

图6 100 g组牙周组织HE染色结果 ×400Fig 6 HE staining of periodontal tissue in 100 g group ×400

图7 各组在不同时间内RORγt mRNA表达变化趋势Fig 7 The expression trend of RORγt mRNA in each group at different times

2.3 ELISA法检测牙周组织中IL-17蛋白的表达

IL-17 蛋白表达量趋势同RORγt mRNA 趋势基本一致（图8）。

同一天数下不同力值组的比较：组间比较显示，三组间在0、1 d的差异无统计学意义（F值分别为0.072、3.904，P＞0.05）；3、5、7、14 d 的差异均有统计学意义（F值分别为82.260、279.354、419.838、297.783，P＜0.05）。50 g 组IL-17 蛋白表达量在3～7 d 显著高于0 g 组；100 g 组IL-17 蛋白表达量在1～14 d 显著高于0 g 组，在3～14 d 显著高于50 g组（P＜0.05）。

同一力值下不同天数的比较：0 g 组不同天数之间的差异无统计学意义（F值为0.545，P＞0.05）；50 g、100 g组的差异均有统计学意义（F值分别为112.942、294.515，P＜0.05）。50 g 组和100 g 组的IL-17蛋白表达量均在3～14 d高于0 d（P＜0.05）。

图8 各组在不同时间内IL-17蛋白含量表达变化趋势Fig 8 The expression trend of IL-17 protein in periodontal tis‐sues of each group at different times

2.4 IHC 法检测牙周组织中RORγt、OPG 蛋白的表达以及TRAP阳性OC数量

2.4.1 RORγt的表达 RORγt阳性表达位于Th17 细胞胞核中，其MOD 变化趋势、同一天数下不同力值组的比较差异以及同一力值下不同天数的比较差异同RORγt mRNA 的基本一致，阴性对照组的Th17细胞胞核中未见棕黄色颗粒（图9、10）。

图9 RORγt IHC染色 ×400Fig 9 RORγt IHC staining ×400

图10 各组在不同时间内RORγt蛋白含量表达变化趋势Fig 10 The expression trend of RORγt protein in periodontal tis‐sues of each group at different times

2.4.2 OPG 的表达 OPG 阳性表达主要位于OB、成纤维细胞、骨衬里细胞和OC 的胞浆、胞膜中，阴性对照组的上述细胞胞浆、胞膜中未见棕黄色颗粒（图11、12）。

OPG 蛋白表达量在50 g 组随加力时间先降低、再升高、后降低趋势，3 d 达最低值、7 d 达最高值，14 d 基本降至基线水平；在100 g 组呈先降低后升高趋势，5 d 降至最低值，且小于50 g 组最低值，14 d仍处于较高水平。

同一天数下不同力值组的比较：组间比较显示3 组之间在0、1 d 的差异无统计学意义（F值分别为0.214、2.752，P＞0.05）；3、5、7、14 d 的差异均有统计学意义（F值分别为26.677、97.737、111.376、14.739，P＜0.05）。50 g 组OPG 蛋白表达量在3 d 显著低于0 g 组，在5 d 显著高于0 g 组；100 g组OPG蛋白表达量在1～7 d低于0 g组、在3～7 d低于50 g组，14 d高于0 g、50 g组（P＜0.05）。

同一力值下不同天数的比较：0 g 组不同天数之间的差异无统计学意义（F值为0.333，P＞0.05）；50 g、100 g组的差异均有统计学意义（F值分别为50.658、56.480，P＜0.05）。50 g 组OPG 蛋白表达量在3 d 低于0 d，在5 d 高于0 d；100 g 组OPG 蛋白表达量在1～7 d 低于0 d，在14 d 高于0 d（P＜0.05）。

2.4.3 TRAP 阳性OC 数量 TRAP 阳性表达位于OC 胞核中，OC 数量变化趋势同RORγt mRNA 变化趋势基本一致，阴性对照组OC 胞核中未见棕黄色颗粒（图13、14）。

同一天数下不同力值组的比较：组间比较显示3 组之间在0 d 的差异无统计学意义（F值为0.441，P＞0.05）；1、3、5、7、14 d 的差异均有统计学意义（F值分别为5.671、21.848、55.702、55.323、63.116，P＜0.05）。50 g 组OC 数在3～7 d高于0 g 组；100 g 组OC 数在1～14 d 高于0 g 组，在3～14 d高于50 g组（P＜0.05）。

图11 OPG IHC染色 ×400Fig 11 OPG IHC staining ×400

图12 各组在不同时间内OPG蛋白含量表达变化趋势Fig 12 The expression trend of OPG protein in each group at different times

同一力值下不同天数的比较：0 g 组不同天数之间的差异无统计学意义（F值为0.517，P＞0.05）；50 g、100 g组的差异均有统计学意义（F值分别为18.475、42.777，P＜0.05）。

50 g 组OC 数在3～14 d 高于0 d，100 g 组OC数在1～14 d高于0 d（P＜0.05）。

3 讨论

Thl7 细胞因大量分泌IL-17 而得名，在初始CD4+T 细胞向其分化的过程中，转化生子因子-β和IL-6 是启动分化因子[6]，通过与信号转导和转录激 活 因 子3 联 合 诱 导RORγt 高 表达[7]。RORγt 是Th17 细胞的特征性核转录因子，可促进Th17 细胞分化，诱导IL-17分泌[8]，Ivanov等[9]将小鼠的RORγt基因敲除后发现，体内Th17 细胞及IL-17 较正常小鼠显著减少，因此RORγt 的含量在一定程度上可大致代表Th17细胞含量。

IL-17 为Thl7 细胞的主要效应细胞因子，具有强大的促炎活性，可介导慢性炎症的发展。既往研究证实，IL-17 在促进牙周炎[10]、根尖周病[11]和颞下颌关节骨关节病[12]等骨丢失性口腔疾病中发挥重要作用。一方面，IL-17 能上调成纤维细胞和OB 上骨吸收因子核因子-κB 受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor‑κB ligand，RANKL）的表达，下调OPG 的表达[13]，直接调节OC 前体细胞的增殖和分化及成熟OC 的形成和活化；另一方面，IL-17 能通过募集和激活免疫细胞促进局部炎症，产生大量炎性细胞因子与RANKL信号转导产生协同作用[14-15]，增强RANKL 表达，间接激活OC 前体细胞。此外，RANKL 在Th17 细胞上高表达也可能参与OC 的形成[16]。成熟OC 活化后会产生大量的TRAP，是检验OC的重要指标。研究[17]发现，在小鼠关节炎模型中，经抗IL-17 治疗后，RANKL 以及TRAP 等OC 标志物的数量明显降低。

图13 TRAP IHC染色 ×400Fig 13 TRAP IHC staining ×400

图14 各组在不同时间内OC数量变化趋势Fig 14 The trend of the number of OC in each group at different times

RORγt 和IL-17 在压力侧牙周组织中表达变化的意义。本研究显示，0 g 组RORγt 和IL-17 含量变化趋势不明显（P＜0.05），说明加力装置对结果影响较小；加力前，这两个因子在牙周组织中均为弱阳性表达，表明其在正常牙周组织中有一定表达量以维持牙周组织的生理状态；50 g、100 g组加力后，这两个因子的表达均呈先升高后降低趋势，50 g 组两因子均在加力5 d 达峰值，14 d 基本恢复基线水平，具有一定周期性，且与OC 数量变化趋势一致，提示适宜正畸力作用下牙周组织发生生理限度内的改建，达到新的骨吸收与沉积的动态平衡。100 g 组两因子均在加力7 d 达峰值且高于50 g 组峰值，14 d 虽较前降低但仍处于较高水平，且与OC 数量变化趋势一致，由HE 及IHC 染色也可观察到100 g 组不仅发生明显的直接骨吸收，而且还在远离牙周膜侧发生潜掘性吸收，以及牙骨质和牙本质的吸收，提示重力使牙周组织过度损伤。100 g 组14 d 时两因子含量虽然仍处于较高水平，但也表现出一定的自限性，可能随着加力时间的延长，力值不断衰减，最终也会建立新的动态平衡，表明100 g 力下牙周组织改建周期较50 g 长，当正畸治疗需施加较大力值时，可以适当延长复诊时间以保证牙周组织充分改建。

OB、成纤维细胞和骨髓基质细胞产生的OPG，又称破骨细胞生成抑制因子，可充当RANKL的诱饵受体，通过竞争性与RANKL结合，阻止RANKL与其受体相互作用[18]，从而抑制OC 分化的终末阶段和基质OC 的活化，诱导OC 细胞凋亡[19]，防止骨组织过度吸收。Kanzaki 等[20]通过将OPG 基因转移到大鼠压力侧牙周组织发现，高水平OPG 在机械应力过程中可抑制RANKL 介导的OC 生成，从而限制牙移动。

OPG 在压力侧牙周组织中表达变化的意义。本实验中，加力初期OPG 稍有降低，可能是由于IL-17随加力时间逐渐增多，对OPG 的抑制作用愈加明显，这与彭娟敏等[21]研究一致。有学者[22]发现，此抑制作用依赖于丝裂原活化蛋白激酶、蛋白激酶B 和核因子κB 信号通路。50 g 组加力5 d时，IL-17开始降低，对OPG 的抑制作用减弱，故OPG 迅速升高，以防止OC 过度活化，促进其凋亡，使牙周组织适度改建，达到生理性牙移动。100 g 组14 d 时OPG 表达 高于0 g 及50 g 组，且 较50 g 组峰值低，是由于14 d 时IL-17 含量仍维持较高水平，压力侧骨改建处于负平衡状态。

50 g 组和100 g 组在不同力下牙齿移动规律也不同。1 d 时，由于牙周膜被压缩，两组牙齿均产生瞬时移动；之后进入移动迟滞期，50 g 组在1～5 d，100 g组在1～3 d移动相对缓慢，此时OC数虽不断上升，但与其发挥作用引起牙齿移动有一定滞后性，这一方面是由于压力使细胞损伤，其分解代谢产物导致组织水肿[23]，另一方面牙周膜中玻璃样变区的清除也需一定时间[24]；50 g 组在5～7 d，100 g 组在3～14 d 随着OC 高表达及障碍的逐渐清除，移动较为快速；50 g 组随后又因OC 数逐渐降至基线水平而移动减缓。在整个阶段，100 g组牙齿移动距离均大于50 g组，这与100 g组Th17细胞相关因子含量及OC数均大于50 g组有关。14 d时100 g 组牙齿移动距离较大，可能是因为潜掘性骨吸收导致骨质疏松多孔，过大的机械力牵引使牙根能迅速占据骨组织中的空虚部分，加之张力侧重力导致牙周纤维韧带断裂，从而产生大量位移。提示在正畸操作时注意施加适宜力值，避免重力对牙周组织的过度破坏；同时，这也给予正畸医生对于控制支抗牙的新思路，可在支抗牙牙周局部注射IL-17 抗体、OPG，以降低OC 活性，增强支抗牙稳固性。

综上，本实验通过体内实验初步证明了Th17细胞通过分泌IL-17 参与了正畸牙压力侧牙槽骨改建过程，在不同力值下，其相关因子表达变化具有一定周期性，趋势同OC 基本一致，但仍需日后再结合体外实验进一步探讨Th17 细胞对于不同力值刺激下免疫炎性反应的具体机制。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。