红花绿绒蒿种子休眠及破除方法研究

陈红刚， 赵文龙， 晋 玲， 李 岩， 刘孜瀚， 杜 弢*

(1.甘肃中医药大学， 甘肃 兰州 730000；2.甘肃百草中药材种植有限公司， 甘肃 兰州 730000)

红花绿绒蒿(MeconopsispuniceaMaxim．)为罂粟科绿绒蒿属草本植物，藏名“阿柏几麻鲁”，主要分布于青藏高原边缘的四川西北部、西藏东北部、青海东南部和甘肃西南部海拔2 800～4 300 m的高山灌丛、林缘、山坡草甸[1]。红花绿绒蒿具有清热、镇痛、降压、止咳、利尿、固涩、解毒、抗菌等功效，作为传统藏药材，可治遗精、肺结核、肺炎、痛经、白带、高血压等[2]。

红花绿绒蒿目前基本为野生，其所处的生态环境脆弱，资源蕴藏量有限。近年来，因生境退化、过度采集等自然环境和人为因素的影响，红花绿绒蒿野生资源遭到严重破坏，面临着枯竭的危险[3]。1999年我国将红花绿绒蒿列为国家二级濒危保护植物[4-5]。由于红花绿绒蒿种子具有休眠现象[6-7]，自然萌发率低，目前尚无人工培育成功的报道。因此，本试验研究红花绿绒蒿种子休眠特性，探索打破种子休眠、提高种子萌发率的方法，旨在为红花绿绒蒿野生抚育及人工驯化栽培提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

红花绿绒蒿种子于2018年8月采自青海省久治县隆格山野生植株，海拔4 317 m (100°51′12.96″ E，33°17′13.49″ N)，由甘肃中医药大学晋玲教授鉴定为红花绿绒蒿(MeconopsispuniceaMaxim.)种子，阴干后室温储存。

油菜(Brassicanapus)种子由兰州市种子管理局提供。

1.2 方法

1.2.1红花绿绒蒿种子净度、千粒重测定 参照GB/T3543对红花绿绒蒿种子进行净度[8]、千粒重[9]的测定。

1.2.2红花绿绒蒿种子吸水率的测定 随机称取风干红花绿绒蒿种子2份，每份1.0 g，1份不做处理(CK)，1份用砂纸轻微打磨种皮，以不露出胚乳为宜，分别浸泡于蒸馏水中，在0，2，4，6，8，10，12，14 h取出种子用滤纸吸干种子表面水分，精密称重(0.0001 g)，重复3次[10-11]。按下列公式计算种子吸水率。

1.2.3红花绿绒蒿种子抑制物提出及生物活性测验[12-14]随机称取风干红花绿绒蒿种子2份，每份5.0 g，分别用研钵磨碎，装入100 mL的磨口锥形瓶中，分别加入10倍量的蒸馏水或80%乙醇，盖瓶塞，置4℃冰箱中恒温浸提24 h，5 000 r·min-1离心10 min后过滤，将残渣继续按相同方法浸提2次，合并3次浸提液，56℃条件下蒸干，加适量水溶解，定容至25 mL，即得0.20 g·mL-1的种子提取液(g·mL-1指每毫升溶液所含提取前红花绿绒蒿种子的质量)。

以0.20 g·mL-1的提取液为母液，配成0(CK)，0.05，0.10，0.15，0.20 g·mL-1的提取液各10 mL，依次将各浓度提取液加入培养皿中，每个浓度处理3皿，每皿1.5 mL，再铺2层滤纸于培养皿中，完成发芽床的制备。以油菜种子为生物活性测验材料，随机选取油菜种子1500粒，随机分成15份，每份100粒，播种于制备好的发芽床上，在恒温20℃、光照12 h·d-1的条件下培养，及时补充水分，24 h统计发芽率，48 h统计根长。

1.2.4红花绿绒蒿种子低温沙藏 随机称取风干红花绿绒蒿种子2份，每份1.6 g，1份不做沙藏处理(4℃冰箱中保存)，1份低温沙藏。具体沙藏方法如下：将洗净的河沙筛成粗沙(18目)和细沙(40目)，经高温灭菌(121℃,30 min)后，在容器底部铺粗沙3～5 cm，再铺细沙5～10 cm，将称好的红花绿绒蒿种子用蒸馏水浸泡16 h后装入纱布网袋中，平铺于细沙上，再盖细沙5～10 cm，沙子湿度为10%～12%，用保鲜膜封住容器，打孔透气，将容器置于冰箱中。变温程序为Ⅰ阶段4～7℃沙藏30 d，Ⅱ阶段0～4℃沙藏30 d，Ⅲ阶段0℃沙藏30 d，Ⅳ阶段-4～0℃沙藏30 d，沙藏结束后将纱布网袋从沙子中取出，倒出种子，于通风处阴干后过筛，获得干净待测种子。

1.2.5红花绿绒蒿种子结构分析与胚率测定 随机选取沙藏与未沙藏红花绿绒蒿种子各10粒，蒸馏水浸泡16 h，OCT胶水包埋冷冻5 min(-20℃)，Leica-CM1950型恒冷切片机切片(厚约0.15 mm)，LeicaDM500显微镜观察种子结构，测量胚率。计算公式如下：

1.2.6红花绿绒蒿种子发芽指标测定 随机选取沙藏与未沙藏红花绿绒蒿种子各300粒，用0.1%的升汞消毒10 min，蒸馏水冲洗5次，播于沙床上(细沙2～3 mm)，每皿播种50粒，6次重复，以未沙藏种子为对照(CK)，在10℃全黑暗条件下培养，及时补足水分，计算发芽率，第7 d统计发芽势。计算公式如下：

1.2.7红花绿绒蒿种子自然层积 随机称取风干红花绿绒蒿种子4份，每份5.0 g，1份于4℃冰箱中保存(CK)，另外3份分别均匀铺装于孔径0.8～1.0 mm的尼龙网袋中，埋藏在海拔3 491 m的红花绿绒蒿野外适生区，土壤湿度20%～40%，埋藏深度为处理Ⅰ(5 cm)、处理Ⅱ(10 cm)、处理Ⅲ(15 cm)，埋藏时间150 d(第一年11月至翌年3月)，取出后用蒸馏水将种子清洗干净，按照1.2.6进行种子发芽率测定。

1.2.8数据分析 使用Microsoft Excel 2007进行数据整理及作图，SPSS 17.0进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 红花绿绒蒿种子形态、净度及千粒重

红花绿绒蒿种子呈肾形，黑色或黄褐色(图1)，长和宽分别为2.02～3.28 mm和1.04～1.90 mm，千粒重0.7919 g，净度96.84%。

2.2 红花绿绒蒿种子吸水率

由图2可知，红花绿绒蒿种子0～2 h吸水率急剧增大，4 h时达到最大吸水率且趋于稳定，10 h之后达到饱和状态，未处理及磨损种皮的红花绿绒蒿种子吸水规律一致，最大吸水率分别为83.25%和91.58%，吸水过程符合种子的一般吸水规律，表明种皮并不影响水分进入红花绿绒蒿种子内部。

图1 红花绿绒蒿种子形态

图2 红花绿绒蒿种子吸水率

2.3 红花绿绒蒿种子生物活性测定

由图3、图4可知，油菜种子发芽率随红花绿绒蒿种子浸提液浓度的增大而降低，根长随提取液浓度的增大而减小，当提取液浓度达到0.15 g·mL-1时，醇提液对油菜种子的发芽抑制率达到了100.00%，水提液对油菜种子发芽抑制率和根长抑制率分别达到91.33%和83.52%，各浓度水提液和醇提液对油菜种子发芽和胚根生长的抑制作用与对照(CK)均有显著性差异(P<0.05)。说明红花绿绒蒿种子内含有萌发抑制物质，对油菜种子发芽和胚根生长有抑制作用，且醇提物抑制作用强于水提物。

2.4 沙藏对红花绿绒蒿种子胚率及发芽情况的影响

红花绿绒蒿种子由种皮、胚、胚乳3部分组成，未沙藏种子的胚发育时期多处于球形或心形胚时期(图5-a，5-b)，胚率为23.30%，沙藏处理后种子的胚发育时期多处于子叶形胚时期(图5-c)，胚率为65.80%，与对照(CK)差异极显著(P<0.01)。未沙藏的红花绿绒蒿种子均不能发芽，沙藏处理后种子发芽率、发芽势有了显著提高，分别达到50.00%和47.67%，与对照(CK)差异极显著(P<0.01，图6)。

图3 红花绿绒蒿种子提取物对油菜种子发芽的影响

图4 红花绿绒蒿种子提取物对油菜种子胚根生长的影响

2.5 自然层积对红花绿绒蒿种子发芽情况的影响

由图7可知，未处理的红花绿绒蒿种子均不能发芽，野外自然层积可以提高种子发芽率、发芽势，处理Ⅰ(5 cm)、处理Ⅱ(10 cm)、处理Ⅲ(15 cm)较未处理(CK)均差异极显著(P<0.01)，且以埋藏深度为10 cm时效果最好，种子发芽率、发芽势分别达到63.34%和49.67%。

图5 沙藏前后红花绿绒蒿种子胚的形态

图6 沙藏对红花绿绒蒿种子胚率及发芽情况的影响

图7 自然层积对红花绿绒蒿种子发芽情况的影响

3 讨论

种子物理休眠是由种皮不透水层引起的一种休眠类型[15]。本研究中未处理及磨损种皮的红花绿绒蒿种子吸水规律一致，浸泡4 h种子最大吸水率分别为 83.25%和91.58%，说明种皮对其萌发不造成透性障碍。种子内部存在抑制物质是种子休眠的主要原因之一[16]。红花绿绒蒿种子水提液和醇提液对油菜种子发芽和胚根生长均有显著抑制作用(P<0.05)，说明红花绿绒蒿种子内含有萌发抑制物质，具有生理休眠的特性[17]，且醇提物抑制作用强于水提物。但是，内源抑制物质在休眠性种子中普遍存在，种类繁多[18]，红花绿绒蒿种子中存在的萌发抑制物质类型还有待进一步研究。

赵春香等[19]等研究表明低温沙藏处理有利于银杏(Ginkgobiloba)种子种胚增长。陈疏影等[20]研究指出，对深度休眠的滇重楼(Parispolyphyllavaryunnanensis)种子进行层积处理，可使种子提前进入形态及生理后熟，快速促进胚的发育，提前解除种子的休眠期。红花绿绒蒿种子经低温沙藏处理后，种子胚率由未处理时的23.30%增长到65.80%，种子发芽率、发芽势由不发芽上升到50.00%和47.67%，较对照(CK)显著提高(P<0.01)，说明红花绿绒蒿具有形态休眠的特性[21]，而低温沙藏能使红花绿绒蒿种子完成形态生理后熟，是打破红花绿绒蒿种子休眠的有效方法。

休眠的种子可以在不适宜幼苗生长的情况下阻止种子萌发，减少子代在恶劣环境萌发的风险，一定程度上保障了种群的延续[22]。红花绿绒蒿作为珍稀濒危的藏药资源，主要分布于自然环境恶劣的青藏高原地区，为了适应该地区的自然环境及延续种群，种子需完成对青藏高原地区环境因素的响应才能萌发[23]。本研究发现在红花绿绒蒿野外适生区进行自然层积是解决种子休眠的有效方法，闫芳等[24]在黄瑞香(Daphnegiraldii)种子上也有类似发现，而通过模拟红花绿绒蒿野外适生区地下10 cm处土壤温度及湿度条件对种子进行层积处理的方法，也为解决该地区同类植物种子的休眠问题提供了参考。

4 结论

红花绿绒蒿种子由种皮、胚、胚乳3部分组成，种胚未发育成熟，种子内含有萌发抑制物质，种皮对其萌发不造成透性障碍。根据Baskin对种子休眠的分类，红花绿绒蒿种子休眠类型为深度复杂形态生理休眠(deep complex，MPD)[25]。低温层积是破除红花绿绒蒿种子休眠的有效方法。