苜蓿抗寒性与根系抗氧化酶活性相关性分析

张玉霞， 丛百明， 王显国， 张庆昕， 杜晓艳， 田永雷

(1.内蒙古民族大学， 内蒙古 通辽 028041；2.内蒙古通辽市农牧业局，内蒙古 通辽 028000；3. 中国农业大学草业科学与技术学院， 北京 100083；4.内蒙古自治区农牧科学院，内蒙古 呼和浩特 010013)

苜蓿作为优质的多年生豆科牧草(Leguminosaesp.)[1]，在畜牧业生产中发挥着重要作用[2]。越冬问题虽然是长期困扰苜蓿生产的老问题，但由于近几年我国北方苜蓿种植面积不断扩大，苜蓿产业发展迅猛，越冬问题已成为制约我国北方苜蓿草地成功建植和草地可持续利用的关键问题。由于科尔沁沙地冬季积雪少，土壤温度变化剧烈，冻害频发，严重制约了该地区苜蓿产业的发展[3]。因此，进一步探究苜蓿的越冬机制，以增加苜蓿防御冻害的能力，提高其越冬率，重新认识苜蓿抗寒性问题是必要的。

国内外关于苜蓿抗寒方面的研究表明，苜蓿越冬器官的超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、过氧化物酶(Peroxidase，POD)、过氧化氢酶(Catalase，CAT)是酶促防御系统的重要保护酶类，对于维护细胞膜系统的稳定性具有重要作用[4-6]，其活性的变化可作为植物的耐寒指标[7-9]，但具体什么时期或在怎样温度条件下进行鉴定尚不明确。目前衡量苜蓿抗寒性主要指标有大田越冬率调查和室内模拟半致死温度(LT50)，LT50采用模拟低温处理通过测定相对电导率或根系活力拟合Logistic方程获得，能够避开生态因子对苜蓿抗寒性的影响[10]。为此，本试验于越冬前期挖取科尔沁沙地生境下种植的黄花苜蓿(MedicagofalcataL.)和4个紫花苜蓿(Medicagosativa)品种的越冬器官，在程序式温度处理箱模拟低温处理，测定不同温度处理下抗氧化酶活性和相对电导率的变化，利用相对电导率拟合Logistic方程得出LT50，通过LT50与抗氧化酶活性变化的相关性分析，分析苜蓿的抗寒性差异及其与抗氧化酶的相关性，为苜蓿抗寒品种的筛选及抗氧化机理研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

苜蓿材料来源见表1。

表1 苜蓿材料名称及来源

1.2 试验地概况

试验地位于内蒙古民族大学科技园区，地理位置为43°30′ N，122°27 E，年平均气温5.5℃，≥10℃年积温为3 000～3 200℃，无霜期140～150 d，年平均降水量约375 mm，年平均风速3.0～4.4 m·s-1，土壤为沙壤土，pH值为8.0，土壤有机质含量0.65%，碱解氮36.37 mg·kg-1，速效磷含量3.81 mg·kg-1，速效钾含量78.51 mg·kg-1，全氮含量0.037%。

1.3 试验设计

采用随机区组试验设计，在科尔沁沙地的沙化草地生境下，于2019年7月15日种植黄花苜蓿和‘骑士T’、‘巨能3010’、‘草原3号’、‘北极熊’紫花苜蓿，播种量15 kg·hm-2，条播行距15 cm，小区面积(2 m×5 m)，3次重复，四周设保护行。灌溉方式为指针式喷灌，肥料在播种时一次性施入，氮磷钾施肥量分别为45 kg·hm-2(纯氮)、200 kg·hm-2(P2O5)、200 kg·hm-2(K2O)，供试肥料分别为尿素(N 46.3%)、重过磷酸钙(P2O544.6%)、钾肥为氯化钾(K2O 60%)。2019年11月15日(封冻前期)每个小区随机挖取50株长势均匀的苜蓿越冬器官，4℃冰箱中储存备用。每个处理分别取20株于程序式低温处理箱采用-10，-15，-20，-25和-30℃模拟低温处理，以0℃为起点，4℃·h-1的速率降温，到达设定温度后保持6 h，然后再按照4℃·h-1速率升温至4℃，在冰箱4℃下保存12 h，以低温(4℃)贮藏为对照(CK)，测定抗氧化酶活性和相对电导率，并依据测定其相对电导率拟合Logistic方程，计算半致死温度。

1.4 测定指标及方法

采用DDS-302电导率仪测定电导率并计算相对电导率[11]；采用NBT光还原法测定SOD活性[11]；采用愈创木酚法测定POD活性[12]；采用紫外吸收法测定CAT活性[11]。

1.5 数据分析

试验数据用Microsoft Excel软件处理、做图和制作表格，SPSS 17.0软件进行方差显著性分析及拟合Logistic方程。

2 结果与分析

2.1 低温胁迫下苜蓿相对电导率的变化及LT50

如表2所示，随着胁迫温度的降低，苜蓿根颈的相对电导率呈增加趋势，其中‘骑士T’、‘巨能3010’、‘草原3号’和‘北极熊’等紫花苜蓿品种根颈的相对电导率则在-15℃低温处理开始显著增加(P<0.05)；黄花苜蓿的相对电导率则在-20℃低温处理开始显著增加(P<0.05)。在CK和-10℃低温处理下不同苜蓿之间的相对电导率无显著差异，-15℃低温处理下黄花苜蓿根颈相对电导率显著低于‘巨能3010’和‘北极熊’(P<0.05)，-20℃处理下黄花苜蓿和‘北极熊’相对电导率显著低于‘骑士T’和‘巨能3010’(P<0.05)，-25℃和-30℃低温处理下黄花苜蓿根颈的相对电导率则分别显著低于‘骑士T’和‘巨能3010’(P<0.05)。根据苜蓿根颈相对电导率结合Logistic回归分析，计算半数致死温度，黄花苜蓿的抗寒性强于紫花苜蓿，4个紫花苜蓿品种的抗寒性为‘北极熊’>‘草原3号’>‘巨能3010’>‘骑士T’。

2.2 低温胁迫下不同苜蓿根颈SOD活性的变化

由表3可知，在不同低温处理下，‘骑士T’、‘巨能3010’、‘草原3号’苜蓿根颈的SOD活性呈先增加后降低的变化趋势，且均在-25℃低温处理下苜蓿根颈的SOD活性最强，与—30℃处理差异不显著。‘北极熊’和黄花苜蓿根颈SOD活性则随着处理温度的降低呈不断增加趋势，其中‘骑士T’和黄花苜蓿则在-20℃处理下开始显著增加，‘巨能3010’、‘草原3号’和‘北极熊’在-25℃处理开始显著增加。-20℃低温处理下黄花苜蓿根颈SOD活性显著高于‘巨能3010’(P<0.05)，-25℃处理下黄花苜蓿根颈SOD活性显著高于‘骑士T’(P<0.05)。—30℃处理下黄花苜蓿的SOD活性显著高于‘骑士T’、‘巨能3010’、‘草原3号’。因此-25℃和-30℃低温处理下苜蓿根颈的SOD酶活性可以作为鉴定苜蓿抗寒性的生理指标。

表2 低温胁迫下苜蓿根颈相对电导率(%)的变化及LT50值(℃)

表3 低温胁迫下苜蓿根颈SOD活性的变化

2.3 低温胁迫下不同苜蓿根颈POD的变化

由表4可知，黄花苜蓿和4个紫花苜蓿品种在低温胁迫下根颈POD活性均呈先升高再降低的趋势。‘骑士T’苜蓿根颈的POD活性在-15℃处理下最高，显著高于对照和-30℃处理(P<0.05)，‘巨能3010’苜蓿根颈的POD活性在-20℃处理下最高，显著高于其他温度处理(P<0.05)，‘草原3号’、‘北极熊’和黄花苜蓿根颈的POD活性在-25℃处理下最高，显著高于其他温度处理(P<0.05)。-20℃，-25℃，-30℃低温处理下黄花苜蓿根颈的POD活性显著高于4个紫花苜蓿品种(P<0.05)。由此说明，抗寒性强的苜蓿材料POD活性增强温度较低，且活性较强。

表4 低温胁迫下苜蓿根颈POD活性的变化

2.4 低温胁迫下不同苜蓿根颈CAT的变化

由表5可知，黄花苜蓿和4个紫花苜蓿品种根颈CAT活性随胁迫温度的降低呈先降低再升高的变化趋势。-10℃低温处理下‘草原3号’根颈CAT活性显著低于其他温度处理(P<0.05)，黄花苜蓿和其他3个紫花苜蓿品种在-20℃低温处理下根颈CAT活性最显著低于-30℃低温处理(P<0.05)。-15℃和-20℃低温处理下‘草原3号’根颈CAT活性显著高于黄花苜蓿和其他3个紫花苜蓿品种(P<0.05)，-25℃低温处理下黄花苜蓿根颈的CAT活性显著高于‘骑士T’、‘巨能3010’、‘北极熊’，-30℃低温处理下黄花苜蓿根颈CAT活性显著高于4个紫花苜蓿品种(P<0.05)。说明‘草原3号’和黄花苜蓿通过增强CAT活性提高苜蓿的抗寒能力。

表5 低温胁迫下苜蓿根颈CAT活性的变化

2.5 低温胁迫下苜蓿根颈抗氧化酶活性与LT50的相关性分析

由表6可知，不同低温胁迫下苜蓿的抗氧化酶活性均与LT50呈负相关，—30℃低温处理下苜蓿根颈SOD和CAT活性与其LT50的相关性达到显著(P<0.05)和极显著水平(P<0.01)，说明—30℃低温胁迫下SOD活性和CAT活性可以作为判断苜蓿抗寒性强弱的敏感指标。

表6 半致死温度与苜蓿根颈中抗氧化酶活性的相关性

3 讨论

关于苜蓿抗寒性的研究主要采用田间自然低温胁迫处理的方法[7]，通过测定翌年的越冬率衡量苜蓿抗寒性的强弱，抗寒生理指标则采用越冬期不同低温处理时期取样测定，这种方法容易受外界气候和土壤环境影响，冬季取样困难。近些年开始采用程序式试验箱人工模拟低温处理方法[13]，利用半致死温度衡量苜蓿的抗寒性，这种方法能够避开其他环境因素的影响，取样测定抗寒生理指标简便易行。本研究则通过大田培养苜蓿材料，采用人工模拟低温处理方法，获得半致死温度判定苜蓿抗寒性差异。结果表明，黄花苜蓿的抗寒性强于紫花苜蓿，4个紫花苜蓿品种的抗寒性为‘北极熊’>‘草原3号’>‘巨能3010’>‘骑士T’。

POD在保护酶系统中主要是降解过氧化物的作用[14]，关于POD活性在低温胁迫下的变化规律，申晓慧研究田间自然低温胁迫下POD活性的变化，表明随着气温的下降而上升，进入深冬又下降，翌年春季气温回升后，又有所回升[7]；崔国文研究表明，POD活性都表现为随着秋末温度的下降而增加，随着寒冷的加剧而迅速下降，再随着翌年温度的回升而缓慢增加，但POD活性与品种抗寒力不呈正相关关系[15]。冯昌军研究表明，随着低温胁迫时间的延长，POD活性呈先增加后降低的变化趋势，抗寒性强的苜蓿品种维持较高的POD酶活性[16]。本研究采用人工模拟低温处理方法研究苜蓿根颈的POD变化规律，结果表明，随着胁迫温度的降低，苜蓿根颈的POD活性呈先增加后降低的变化趋势，与申晓慧[7]、崔国文[15]、冯昌军[16]的研究结果一致，但与崔国文研究不同的是，苜蓿根颈的POD活性与苜蓿的抗寒性呈正相关，这与南丽丽[17]、申晓慧[7]、朱爱民[18]的研究结果一致，通过与苜蓿抗寒性的相关性分析表明，苜蓿根颈的POD活性与苜蓿抗寒性的相关性不显著，因此POD活性不能作为鉴定苜蓿抗寒性的生理指标。

CAT具有将低温胁迫下产生的H2O2分解成水的作用[19]。关于低温胁迫下苜蓿根颈CAT活性的变化规律研究较少，杨秀娟采用田间自然低温胁迫处理研究，表明2个紫花苜蓿品种根颈中CAT活性均随着温度的降低而呈现先上升后下降的趋势，在初冬时达到最大值，进入深冬，则有不同程度的波动，且活性下降明显[20]。本研究采用模拟低温胁迫处理，研究苜蓿根颈CAT活性的变化，与其结果不同，随着冷冻胁迫温度的降低，苜蓿的CAT活性呈增加的变化趋势，在—30℃低温胁迫下黄花苜蓿和4个紫花苜蓿品种根颈的CAT活性最强，相关性分析表明，在-10℃和—30℃低温处理下苜蓿根颈的CAT活性与苜蓿的抗寒性呈显著正相关，说明-10℃和—30℃低温处理下苜蓿根颈的CAT活性都可以作为苜蓿抗寒性的鉴定指标。

4 结论

科尔沁沙化草地种植的苜蓿抗寒性为黄花苜蓿强于紫花苜蓿，4个紫花苜蓿品种的抗寒性为‘北极熊’>‘草原3号’>‘巨能3010’>‘骑士T’。LT50与不同低温胁迫下抗氧化酶活性相关性分析表明，—30℃低温处理下SOD活性和CAT活性以及-10℃低温处理下的CAT活性可以作为苜蓿抗寒鉴定的敏感指标。