血管紧张素Ⅱ对血管平滑肌细胞迁移的影响及分子机制

帅 维 张 伟 范致星

(武汉大学 人民医院 心血管内科， 湖北 武汉 430061)

动脉粥样硬化等阻塞性血管疾病的发生发展与血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)的迁移密切相关[1]。现有研究表明，VSMCs的迁移水平受细胞内外多种生物学信号的调节，其中炎症通路的激活发挥了至关重要的作用[2]。血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)是肾素-血管紧张素系统中最重要的炎症递质，可以诱导动脉粥样硬化斑块中多种炎症因子的表达[3,4]。Ang Ⅱ作为一种化学诱导物[5]，可通过结合AngⅡ-1型受体(Ang Ⅱ-type 1 receptor，AT1R)，激活细胞内的信号转导通路(如MAPK、JNK、NF-κB)，诱导免疫和炎症反应，进而刺激VSMCs迁移[6]。但由于AT1R下游分子信号复杂，涉及多种调控通路，Ang Ⅱ促VSMCs迁移的具体分子机制仍未完全阐明。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(Akt)是参与动脉粥样硬化发生发展的重要信号通路，在调控VSMCs功能状态中发挥重要作用[7]。PI3K/Akt通路同时受到了多种上游信号分子的调控，研究表明AT1R与PI3K/Akt通路亦有交互效应[8,9]。因此，本实验将通过体外培养大鼠胸主动脉VSMCs，以探讨AT1R依赖的PI3K/Akt通路激活是否参与了AngⅡ介导的VSMCs迁移。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

重组人Ang Ⅱ(Sigma公司)；脂质体2000转染试剂(Invitrogen公司)；PI3K抑制剂(LY294002，Calbiochem公司)；Akt抗体和磷酸化Akt抗体(Cell Signaling 公司)；Control siRNA、AT1R siRNA、AT1R抗体、PI3K抗体和GAPDH 抗体(Santa Cruz公司)。

1.2 VSMCs的培养、鉴定

取雄性SD大鼠(约150 g)的胸主动脉，分离培养原代VSMCs。DMEM培养基中加入青霉素(100 U/mL)和链霉素(100 μg/mL)，于37℃的5%CO2培养箱中培养，取3～5代VSMCs用于后续研究。根据细胞形态学及特异抗体SM-α-Actin对VSMCs进行鉴定。

1.3 细胞活性测定

采用不同浓度的Ang Ⅱ(0.1～1000 ng/mL)刺激VSMCs，然后用0.4%台盼蓝染液处理Ang Ⅱ刺激后的VSMCs，5 min后光镜下观察细胞染色情况。未染色细胞占总细胞数的比例即细胞活性，用于评估Ang Ⅱ对于VSMCs的细胞毒性。

1.4 细胞迁移实验

Transwell小室的上室接种胰酶消化后的VSMCs(密度约5×104/孔)；下室加入含0.1～1 000 ng/mL浓度梯度的Ang Ⅱ，37℃的5% CO2培养箱中孵育12 h。取出滤膜，甲醇固定并苏木素染色，光镜下观察迁移到滤膜下室面的VSMCs并计数。

1.5 实验分组

分为Control对照组、AT1R siRNA转染组、Control siRNA转染组和PI3K抑制剂(LY294002)干预组。运用Lipofectamine 2000将等量的AT1R siRNA或Control siRNA转染至VSMCs，48 h后RT-PCR与Western blot检测AT1R的表达情况。

1.6 RT-PCR检测AT1R基因的表达

Trizol法抽提总RNA，并逆转录成cDNA。RT-PCR由ABI Prism7500完成，RT-PCR 反应条件为95℃ 10 s，60℃ 10 s，75℃ 20 s；共40个循环，使用2-ΔΔCt方法进行结果分析。实验中所用引物序列如下：

AT1R：上游5′-AAGGGCTACCAGAGCGATCA-3′，下游5′-GGTATTGCCAGGTGCACAAA-3′；

GAPDH：上游5′-GACAACTTTGGCTCGTGGA-3′，下游5′-ATGCAGGGGTTCTGG-3′。

1.7 Western blot检测相关蛋白的表达

PBS洗涤细胞后，提取细胞蛋白，凝胶电泳后将蛋白转移至硝酸纤维素膜。5%脱脂奶粉封闭后，加入AT1R、磷酸Akt(Ser-473)、Akt及GAPDH的一抗4℃孵育过夜，漂洗后加入辣根过氧化物酶标记的二抗进行孵育。采用ECL化学发光检测试剂盒进行显影，并采集图像。

1.8 PI3K的活性测定

100 ng/mL的Ang Ⅱ处理AT1R siRNA和Control siRNA转染后的VSMCs， 6 h后裂解VSMCs并测定PI3K活性[10]。在各组样本(500 μg)中加入PI3K抗体4℃孵育过夜。将获得的免疫复合物采用蛋白琼脂糖小体处理2 h，离心后收集样本。采用竞争性ELISA试剂盒检测PI3K的活性。

1.9 统计学分析

采用SPSS 22.0软件包进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示。组间比较采用单因素方差分析，各组间的两两比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Ang Ⅱ对VSMCs迁移的影响

显微镜下观察到VSMCs呈典型的“峰谷”样生长。SM-a-Actin免疫染色证实细胞纯度大约为90%。细胞活性证实，0.1～1000 ng/mL的Ang Ⅱ未对VSMCs造成细胞毒性(见图1A)。Ang Ⅱ可明显促进VSMCs迁移(均P<0.05)，且VSMCs迁移效应在Ang Ⅱ浓度为100 ng/mL时达到最大(见图1B)。

2.2 AT1R在Ang Ⅱ介导VSMCs迁移中的作用

为探讨AT1R在Ang Ⅱ介导VSMCs迁移中的作用，本实验首先用AT1R siRNA转染VSMCs 48 h，然后用Ang Ⅱ(100 ng/mL)刺激12 h。检测发现，AT1R siRNA组中的AT1R表达水平显著下降(P<0.05，见图2A)，Ang Ⅱ诱导的VSMCs迁移也明显受抑(见图2B)。

注：A：细胞活性实验检测0.1～1000 ng/mL的Ang Ⅱ对VSMCs的细胞毒性作用；B：Transwell小室法检测0.1～1 000 ng/mL的Ang Ⅱ对VSMCs迁移的影响；与对照组相比，*P<0.05图1 Ang Ⅱ对VSMCs迁移的影响

注：A：Control siRNA和AT1R siRNA转染VSMCs 48 h后，RT-PCR和Western blot检测AT1R的mRNA及蛋白表达水平，与Control siRNA转染组相比，*P<0.05；B：Control siRNA或AT1R siRNA转染VSMCs后， 100 ng/mL Ang Ⅱ刺激12 h后所测得的VSMCs迁移活性。与Control组相比，*P<0.05；与AngⅡ+ Control siRNA转染组相比，#P<0.05图2 AT1R在AngⅡ介导VSMCs迁移中的作用

2.3 PI3K/Akt信号通路在AngⅡ介导VSMCs迁移中的作用

VSMCs经100 ng/mL的 AngⅡ处理后，PI3K活性和Akt(Ser-473)磷酸化水平均显著增加(均P<0.05)。但Ang Ⅱ刺激AT1R siRNA预先处理的VSMCs，PI3K/Akt信号通路却被明显抑制(P<0.05，见图3)。上述结果提示，Ang Ⅱ可能依赖AT1R激活PI3K/Akt信号通路而介导VSMCs迁移。

2.4 PI3K在AngⅡ介导Akt 激活和VSMCs迁移中的作用

上述结果已表明PI3K与VSMCs的迁移有关。为进一步验证PI3K参与了AngⅡ介导的Akt激活和VSMCs迁移，我们用Ang Ⅱ刺激经PI3K抑制剂LY294002(10 μM)预处理后的VSMCs。结果表明，LY294002预处理能抑制Akt磷酸化活化(P<0.05，图4A)，同时能明显拮抗VSMCs迁移(P<0.05，图4B)。上述结果进一步证实，PI3K在AngⅡ介导的Akt活化和VSMCs迁移中发挥重要作用。

注： A：PI3K的活性测定；B：总Akt及磷酸化Akt(Ser-473)的表达水平。与Control组相比，*P<0.05；与An gⅡ+ Control siRNA转染组相比，#P<0.05图3 AngⅡ通过AT1R激活PI3K/Akt途径介导VSMCs迁移

注：A：LY294002对Akt(Ser-473) 磷酸化水平的影响；B：LY294002对Ang Ⅱ介导VSMCs迁移的影响。与Control组相比，*P<0.05；与Ang Ⅱ组相比，#P<0.05图4 LY294002抑制Ang Ⅱ介导的Akt磷酸化和VSMCs迁移

3 讨论

动脉粥样硬化等阻塞性血管疾病涉及多种细胞、多种因子的参与，其中VSMCs的迁移是该类疾病发生的病理基础。VSMCs的病理性活化促进动脉粥样硬化斑块的进展和最终斑块的破裂。研究发现，动脉粥样硬化等阻塞性血管疾病患者体内Ang Ⅱ的水平明显升高，而Ang Ⅱ的上升，一方面能够通过促进血管内皮细胞的损伤，增加内皮下胶原成分的暴露，促进粥样斑块的形成；另一方面，Ang Ⅱ还能通过激活其受体AT1R介导的炎症反应来促进VSMCs的迁移，加速粥样斑块的形成[11,12]。

既往研究表明，抑制目前已证实的炎症相关信号通路并不能完全有效地抑制Ang Ⅱ介导的VSMCs迁移，提示有更多未阐明的分子通路参与了此过程[13]。因此，有必要更加深入探究Ang Ⅱ介导VSMCs迁移的分子机制。PI3K/Akt信号通路作为一种经典的信号通路参与了多种病理生理过程，在细胞迁移、增殖等过程中发挥了重要作用，已有研究证实其与动脉粥样硬化疾病密切相关[10]。Akt作为PI3K下游信号分子，可被PI3K磷酸化，磷酸化的Akt又可介导VSMCs迁移[14]，同样有研究发现PI3K/Akt也是AT1R下游信号通路[8,9]。鉴于已有研究，我们推测：Ang Ⅱ与AT1R结合后可通过激活PI3K/Akt介导VSMCs迁移。本研究结果表明，VSMCs在Ang Ⅱ处理后迁移能力显著增加，而AT1R siRNA可显著抑制该效应，这与已有的结果一致，证实AT1R参与了这一过程。与此同时，我们还发现AT1R siRNA处理后，VSMCs的PI3K活性和Akt磷酸化亦被明显抑制。而且，LY294002抑制PI3K后，VSMCs迁移能力及Akt的磷酸化均可被抑制。因此，Ang Ⅱ可通过激活AT1R/PI3K/Akt信号通路介导VSMCs迁移。

然而，从已有的结果中我们还可以发现，Ang Ⅱ介导的VSMCs迁移并不会因沉默AT1R或是抑制PI3K的表达而完全被抑制。由此，我们推测Ang Ⅱ介导的VSMCs迁移机制复杂，可能有多种的受体及信号通路参与其中，需要进一步研究证实。

综上所述，本研究发现Ang Ⅱ介导的VSMCs迁移与AT1R/PI3K/Akt信号通路的激活密切相关。相关研究结果进一步揭示了Ang Ⅱ介导VSMCs 迁移的分子机制，也为阻塞性血管疾病的治疗提供了新靶点和新思路。