AcrAB-TolC外排泵在多重耐药肠杆菌中的作用研究进展

华炜聪　邓在春　张筠　朱丹萍　陈众博

[摘要] 耐多药肠杆菌的出现严重威胁着人类健康。AcrAB-TolC外排泵的过量表达是引起肠杆菌多重耐药的主要机制之一，其主要由周质融合蛋白AcrA、外膜通道蛋白TolC和药物质子转运子AcrB构成，受整体调控因子、局部调控因子以及环境中的化学物质等调节。对AcrAB-TolC外排泵的研究，不仅有助于阐明相关耐药本质，还有助于研制有临床意义的外排泵抑制剂（EPIs），为解决肠杆菌多重耐药问题提供新思路。本文对AcrAB-TolC外排泵的结构、调控等方面的研究进展作一综述。

[关键词] AcrAB-TolC;外排泵;肠杆菌;多重耐药

[中图分类号] R378.2          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2021）04-0184-05

Research progress of AcrAB-TolC efflux pump in multidrug resistant enterobacteria

HUA Weicong1   DENG Zaichun1， 2   ZHANG Yun2   ZHU Danping2   CHEN Zhongbo1， 2

1.Ningbo University School of Medicine， Ningbo   315020， China; 2.Department of Respiratory Medicine， the Affiliated Hospital of Medical School of Ningbo University， Ningbo   315020， China

[Abstract] The emergence of multidrug-resistant enterobacteria poses a serious threat to human health. Overexpression of AcrAB-TolC efflux pump is one of the main mechanisms that causes multidrug resistance in enterobacteria. It is mainly composed of periplasmic fusion protein AcrA， outer membrane channel protein TolC and drug proton transporter AcrB， and is regulated by global regulatory factors， local regulatory factors and chemicals in the environment. The study of AcrAB-TolC efflux pump is not only helpful to clarify the nature of drug resistance， but also helpful to develop clinically significant efflux pump inhibitors（EPIs）， providing new ideas for solving the problem of multiple drug resistant enterobacteria. This article makes a review on the research progress of the structure and regulation of AcrAB-TolC efflux pump.

[Key words] AcrAB-TolC; Efflux pump; Enterobacteria; Multidrug resistance

隨着抗生素使用的日益增多，细菌多重耐药问题已成为全球公共卫生危机[1-2]。多重耐药是指细菌对三种及以上的抗生素同时耐药。目前临床观察到的重症细菌感染中，多重耐药的肠杆菌较多。药物外排泵是肠杆菌产生多重耐药的主要机制之一[1，3]，其化学本质为蛋白质。抗生素或有毒化合物存在时，外排作用可能是肠杆菌应激反应中最快和最有效的抵抗机制[3]。革兰阴性杆菌中最具临床意义的外排泵是耐药结节细胞分化（Resistance nodulation-cell division，RND）家族的成员，能识别广泛的底物，与多重耐药相关。这些外排泵以三聚体方式存在，横跨细菌内外膜;其中，AcrAB-TolC系统是最经典的RND家族，多存在于肠杆菌科细菌[4]。肠杆菌中存在许多膜孔蛋白，可以根据分子的大小、形状和电荷等选择性地允许分子（包括抗生素）被动扩散[5]。当细胞内的药物浓度聚集达到一定数值时，AcrAB-TolC外排泵以质子驱动力为能力将其泵出，从而增强了细菌在不良环境中的生存能力。因此，细胞内的药物浓度也是药物流入和流出之间的平衡点。AcrAB-TolC系统可能在细菌耐药质粒传播方面有一定的推动作用[6]。此外，其也是大多肠杆菌毒力和生物膜形成所必需的[7-8]。对部分细菌来说，该泵表达水平决定多重耐药表型，泵失活则菌株可从多重耐药变回敏感。所以，进一步研究AcrAB-TolC泵对临床具有重要意义。若能研制出有临床价值的外排泵抑制剂，将极大帮助临床医生的用药，恢复现有抗生素的临床疗效，降低多重耐药细菌感染所致的死亡率，是细菌多重耐药问题上的重大突破。

1 AcrAB-TolC外排泵的结构

1.1 AcrAB-TolC外排泵结构蛋白的组成

AcrAB-TolC外排泵主要由周质融合蛋白AcrA、外膜通道蛋白TolC和药物质子转运子 AcrB构成。外排功能的实现需要三者共同参与，缺一不可。否则，即使存在其他能够增强外排泵功能的机制，细菌仍然不会产生耐药性。不过，Saw等[9]的实验侧面印证了Doumith等实验结论“在耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌分离株中acrB mRNA转录物的表达没有增加”，说明AcrAB-TolC系统可能并不是肠杆菌必需的耐药机制。

AcrA、AcrB和TolC蛋白以三聚体的形式存在。其中AcrA蛋白被认为在膜融合中起到了一定作用，其位于周质间隙中，其C端肽链连接着内膜上AcrB，N端肽链则在C端的协助下与外膜通道蛋白TolC相互作用[10]。AcrA近膜端结构域的构象变化对AcrAB- TolC的组装至关重要，可以作为开发新型泵抑制剂的靶点[11]。AcrA蛋白缺失时，可由其同源周质融合蛋白AcrE补充，两者同源性为68.5%，功能相似。相关实验证明，若要以周质融合蛋白为泵抑制剂的药物靶点，必须同时作用于AcrA和AcrE蛋白才有效[12]。AcrB蛋白位于细胞内膜，其能捕获来自细胞周质的物质，并将有害的物质排出细胞，称为细菌的“吸尘器”[13]。有研究发现，AcrB蛋白缺失后，与其同源的RND外排泵系统如AcrD、AcrF蛋白会代偿性产生，这样既可以保证细菌细胞膜的结构完整，又能维持外排功能[14]。但若AcrB蛋白只是处于失活状态，则不会发生以上蛋白的代偿性生成。不过，AcrD和AcrF蛋白的生成水平低至无法检测，这意味着实际上，AcrD和AcrF蛋白无法补救AcrB蛋白缺失致外排功能丧失后所带来的影响[5]。TolC蛋白位于细胞外膜，为排出的药物和毒素提供了一条穿越细菌外膜的途径。有研究发现，细菌细胞的药敏性与TolC变异体的浓度变化不相匹配。无论实验组细胞的TolC蛋白浓度低于还是高于对照组的TolC蛋白浓度（浓度相差至少10倍），大部分常用抗生素的MIC仍保持不变，说明即使将TolC蛋白抑制到极低浓度，也无法限制外排泵的药物外排能力，从中可推测只有一小部分TolC蛋白参与外排作用[15]。所以对新药研发来说，TolC蛋白并不是抑制多药外排的良好靶点。

1.2 AcrAB-TolC外排泵的作用过程

革兰阴性杆菌由于有双膜结构，实现外排途径较复杂。Shi等[16]认为，AcrA-TolC泵的开启和抗生素的泵出是一个短暂的过程，大部分时间组件均处于封闭状态，而不是活跃状态。通过断层扫描数据进一步揭示AcrAB-TolC外排泵的组装顺序。首先，AcrB与AcrA蛋白结合形成二聚体AcrAB。然后，AcrA改变构象以嵌合TolC。一旦TolC与AcrAB二聚体结合，组装完全的外排泵保持静止状态。当AcrB遇到药物分子时，该泵开放通道，沿通道长轴收缩，使底物（药物）通过通道排出细胞，待底物排出后立即关闭[13，17]。不同于寻常那些狭小、紧密贴合的结合位点，AcrAB-TolC外排泵转运蛋白结合药物分子的位点通常较宽大，以允许用更少的自由能去容纳更多的底物[18]。AcrAB-TolC外排泵大多为非特异性的，可以排出多种不同作用机制和不同作用位点的抗生素，但也有少数是特异性的，如四环素外排泵。

2 AcrAB-TolC外排泵的调控因子

AcrAB-TolC外排泵的调控分为整体调控和局部调控两种，整体调控因子有MarA、RamA、Rob、SoxS等，局部调控因子主要有AcrR，本文主要对整体正调控因子MarA和RamA及局部负调控因子AcrR作一综述。

2.1 MarA蛋白对AcrAB-TolC外排泵的正向调节

MarA蛋白是一种整体转录激活子，增加AcrAB-TolC泵的外排作用，属于AraC/XylS家族蛋白的成员。在操纵子mar家族中，除marA外，参与多重耐药机制的还有marR、marB。marA基因虽然总是被MarR抑制，但其编码的MarA蛋白能够与marR基因阻遏位点上游的DNA序列（即marbox）结合以发挥正反馈作用，从而抑制marR基因并激活marA基因。MarR蛋白除了可以抑制acrAB基因表达，在没有任何环境信号影响时，也可阻止自身转录。marB基因可增加marA基因的表达水平，在转录后起作用，具体机制不明[19]。

至今，仍有不少学者认为，Mar突变体仅仅是通过促使AcrAB-TolC外排泵系统过度表达而引起多重耐药。其实不然，mar系统对其他基因也有调节作用，有些还参与了对特定药物的耐药机制。Sharma等[20]通过实验鉴定了33个受MarA蛋白调控的靶基因，发现除acrAB和tolC基因外，MarA蛋白还能上调在脂质转运、DNA损伤修复和转录调控中起作用的基因，从而减少抗生素渗入和DNA损伤。

2.2 RamA蛋白对AcrAB-TolC外排泵的正向调节

RamA蛋白是MarA蛋白的同系物，也属于AraC/XylS家族。与MarA一样，RamA通过直接结合acrAB和tolC基因位點上游的退化核苷酸序列（即rambox）而激活acrAB和tolC[5]。ramR基因位于ramA的上游，其能抑制ramA的转录，同样，RamA蛋白也能抑制RamR蛋白的结合。当ramR基因缺失或失活时，RamA蛋白则会过量表达，引起多重耐药[21-23]。多数AcrAB-TolC外排泵的底物无法诱导RamA蛋白的表达，而当AcrB蛋白失活后，RamA可呈四倍速增长。当AcrAB-TolC泵部分失活或加入外排泵抑制剂时，RamA的表达量明显升高[19，24]。沙门氏菌在RamA蛋白缺失的情况下，筛选出MDR突变体很困难，这意味着，RamA在沙门菌多重耐药机制中是主要的调控因子[25]。不过少数肠杆菌中不存在RamA蛋白，如大肠埃希菌。

氯丙嗪能以浓度依赖的方式诱导RamA蛋白，Ricci等[26]先通过氯丙嗪诱导RamA蛋白过量表达，再去除氯丙嗪，发现RamA蛋白的量立刻恢复至诱导前的水平，推测过高水平的RamA蛋白或过量的AcrAB-TolC系统可能对细菌有害，且认为有另一种调节机制在维持平衡。外排泵的高能量需求是其不过度表达的可能因素。进一步的实验表明，RamA蛋白的量能够恢复到诱导前的水平是通过Lon蛋白酶的调节。该酶可以水解RamA、MarA蛋白等，若Lon突变可导致AcrAB蛋白和多重耐药的增加[19]。

2.3 AcrR蛋白对AcrAB-TolC外排泵的负向调控

局部调控因子AcrR抑制acrAB基因的过表达[27]。acrR基因位于acrAB操纵子的上游，与acrAB基因转录方向相反。AcrR蛋白N端存在DNA结合的螺旋-转角-螺旋结构基序，C端存在特异性配体结合序列。毒性化合物能与AcrR蛋白的C端结构域结合，引起其N端结构域的构象改变，AcrR蛋白从DNA中释放，使靶基因（即acrAB基因）得以转录[28]。反之，AcrR蛋白再与acrAB基因调控区特异性结合发挥泵抑制作用。有研究发现，AcrR蛋白缺失除了增加耐药性，还可提高细菌的活性、黏附、毒力，促进生物膜的形成等[27]。同MarR蛋白一样，AcrR蛋白也能抑制自身的合成。

3 环境因素对外排泵的调控作用

大量环境因素也能调控外排泵系统。肠杆菌大多存在于宿主消化道中，常与胆汁、脂肪酸和阳离子肽等环境诱导因子接触，这些环境诱导因子与Rob蛋白结合从而诱导AcrAB蛋白过表达，以助肠杆菌生存[19]。Urdaneta等[29]实验证明，亚致死浓度的胆盐诱导acrAB基因转录的上调，对肠杆菌早期适应宿主环境至关重要。进一步实验发现，在缺少单个或多个外排泵系统的沙门氏菌突变体中，只有AcrAB蛋白缺失的突变体无法在亚致死浓度的胆盐环境下生长，揭示了AcrAB蛋白对细菌胆汁耐受的重要性。另有研究证实，大量环境刺激可以增加ramA基因的表达以激活AcrAB蛋白，如细菌代谢产物吲哚[30]、苯噻嗪、血清素摄取抑制剂、氯丙嗪等抗精神药物、生物杀菌剂、某些抗生素和温度[24]。

4 药物治疗后的细菌外排作用可能更强

Adler等[31]将大肠埃希菌暴露于美罗培南或厄他培南中进行60次传代，通过基因组测序后发现，AcrAB-TolC介导的外排作用较前增强。不止体外研究结果如此，临床中亦有文献报道，来源于同一患者的沙门氏菌，抗感染治疗失败后的菌株较治疗前的菌株外排泵功能更强，AcrB蛋白的表达更多。Blair等[32]进一步对AcrB蛋白基因测序发现，药物诱导株中甘氨酸替代了第288位的天门冬氨酸，推测该突变使AcrB蛋白结合位点结构发生改变。虽然这不能代表此种突变的菌株对所有抗生素的外排功能都增强，但也提示不合理的抗感染治疗可能会加重耐药问题。

5 外排泵抑制剂的研发意义

在新型药物的研制中，外排泵是一个有潜力的突破点[33]。經典的抗耐药菌药物β-内酰胺酶抑制剂，虽在临床上应用价值很大，但只针对于产β-内酰胺酶的细菌。而外排泵抑制剂（Efflux pump inhibitors，EPIs）可能同时增加多种细菌对多种抗生素的敏感性，这是因为外排泵绝大多数是非特异性的，广泛存在于各种生物体中。EPIs还可以减少细菌筛选耐药突变体的机会[34]。有实验[8]证明，EPIs具有阻止药物排出和干扰生物膜形成的能力，从而增强抗生素作用，逆转细菌的耐药性。理想的EPIs能够抑制存在于各种病原体且来自不同家族的外排泵，但这极具挑战性。因此，针对特定的外排泵家族来设计窄谱EPIs可能是最佳的选择。不过，有临床价值的EPIs除了能有效抑制外排泵的功能，还需满足毒性低、与抗生素具有协同作用、不对缺乏外排泵的敏感菌株产生影响等条件。

EPIs可通过干扰外排泵的表达和组装、阻断能量来源、阻碍底物通过外排通道等机制发挥作用。最早研发的可以对抗革兰阴性菌中RND家族泵的抑制剂是PAβN（Phe-Arg-β-naphthylamide，又称MC-207110），其机制是竞争性结合外排泵相应位点以阻止其他底物与该位点的结合，但因毒性问题和低稳定性限制了其临床的应用[7]，与其相同机制的还有喹啉衍生物、MBX2319[34]等;CsrA可以作为抑制剂，使acrAB基因转录不稳定，影响AcrAB-TolC系统的功能[5];反义技术如肽结合磷酸二胺酯吗啡低聚物（PPMOs）可以抑制外排泵的表达，可能对大环内酯类或氟喹诺酮类药物的治疗有利[35];预设计锚蛋白重复蛋白（Designed ankyrin repeat proteins，DARPins）可抑制AcrA和AcrB蛋白的相互作用[11];羰基氰间氯苯腙（CCCP）主要通过阻断外排泵的能量来源发挥抗耐药作用[36];还有一些偶然发现的天然EPIs，如糖槭中提取的富酚枫糖浆提取物[34]，目前机制不明。此外，已在临床上应用的药物也是EPIs的来源。其中，抗癌药物有望成为EPIs的候选药物。因细菌细胞和癌细胞均能产生对有毒化合物的抗性，而这种抗性通常是由于外排泵的过表达造成的[37]。尽管发现了大量潜在的外排泵抑制剂，不幸的是，尚没有一种被批准用于临床[38]，故EPIs的研发工作仍任重而道远。

需要注意的是外排泵抑制剂不能滥用。Saw等[9]发现，加入外排泵抑制剂PAβN反而会增加细菌对某些抗生素的耐药。所以今后临床上对外排泵抑制剂的合理应用十分重要，应仔细评估后再选择，以确保不会适得其反。

肠杆菌为适应不良环境，通过外排泵以排出有毒物质或代谢产物，形成多重耐药现象。尽管临床上可使用的抗菌药物有数百种，但针对多重耐药甚至全耐药菌，仍常面临着无药可用的境地，且这种情况随着抗菌药物的广泛使用愈发常见。众所周知，一款新型抗菌药物的研制及推广需要花费的时间和经费是庞大的。如果换种思路，将研究放在泵抑制剂的研发上，辅助现有抗生素的抗菌作用，可以恢复多种抗菌药物的临床疗效，也极大节省了紧张的医疗资源。尽管对AcrAB-TolC系统已进行不少的研究，但有价值的临床应用尚未发现，故仍需要更多的深入研究。

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（收稿日期：2020-03-02）