探讨卵巢上皮性癌组织中USP10与p14ARF表达及临床预后意义

王娜，王丝雨，邢双双

（郑州市第三人民医院妇科，河南 郑州 450000）

卵巢上皮性癌是卵巢癌中最常见的类型，其发病率约占卵巢恶性肿瘤的70%，死亡率占各类妇科肿瘤的首位，已严重威胁女性生命安全[1-2]。该疾病发病隐匿，早期症状不明显，大部分患者确诊时处于晚期，此时手术切除效果差，放化疗治疗后容易复发，严重影响患者预后生存率[3]。因此，探索新的生物标志物早期确诊已成为目前卵巢癌治疗的研究热点。泛素特异性蛋白酶10（USP10）是一种要参与泛素依赖的蛋白质分解代谢及泛素周期等生命过程的去泛素化酶，既往研究发现，USP10具有抑制肿瘤细胞生长的效果（肺癌、肝癌）[4-5]。p14ARF是新发现的一个抑癌基因，在肿瘤的发生发展以及细胞周期、细胞凋亡方面具有重要作用（如前列腺癌）[6]。目前国内尚未见关于USP10、p14ARF与卵巢上皮性癌预后的研究报道。因此，本次研究主要是分析卵巢上皮性癌组织中USP10与p14ARF表达及临床预后意义，从而为卵巢上皮性癌的诊治提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年1月至2016年1月在我院住院治疗的120例卵巢上皮性癌患者作为本次研究对象。其中年龄30～72岁，平均（52.34±5.28）岁，同时按照国际妇产科联合会FIGO分期标准[7]将肿瘤分为I～Ⅱ期66例，Ⅲ～Ⅳ期54例。同时收集经术后病理检查确诊的120例癌组织标本以及120例非癌组织标本。本次研究已获得我院医学伦理委员会批准。纳入标准：⑴术后经病理检查已确诊为上皮性卵巢癌；⑵告知患者及家属并签署知情同意书；⑶术后均行常规放化疗者。排除标准：⑴伴有代谢性疾病、凝血功能障碍疾病、免疫功能障碍疾病、肝肾功能障碍疾病、严重感染性疾病、心血管系统疾病；⑵合并其它肿瘤疾病者；⑶术前进行放化疗或激素治疗者；术后再次手术者；⑷既往精神病史者；⑸临床资料不完整或中途退出研究者。本研究采用门诊、电话、微信及上门等多种方式结合进行随访，随访时间自病理确定日开始至2021年1月30日截止，随访终点事件为患者死亡或肿瘤复发/转移，随访时间为3～60个月。

1.2 方法

1.2.1检测方法 采用免疫组化染色检测本研究对象USP10、p14ARF表达水平。将切片常规地脱蜡并用含有3%过氧化氢的甲醇处理30 min，然后在室温下将切片在正常血清（50μl/切片）中封闭10 min，并与一抗（USP10、p14ARF）或PBS液（阴性）一起孵育对照，并于4°C过夜，与生物素偶联的二抗（50μl/节）在室温下孵育10 min后，加入50μl链霉亲和素过氧化物酶，然后在室温下孵育10 min。然后根据染色强度（用显微镜观察），用新鲜制备的DAB溶液处理切片3～10 min，将切片在PBS中洗涤3次（每次3 min），染色后，将切片用苏木精复染2 min，然后用乙醇的HCl处理。将切片在水中洗涤，在乙醇中脱水，在二甲苯中透明化，用中性树胶固定，并在光学显微镜下观察。

1.2.2 结果判定[8]免疫结果由两位副高职称的病理医师盲审完成，二者结果不一致时经第三医师判定。首先计算随机的高倍视野（10个，×400）中阳性细胞数占肿瘤细胞总数百分比,＜5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分。USP10、p14ARF阳性细胞特征分别为：USP10定位在胞浆，呈棕黄色或棕褐色颗粒；p14ARF定位于细胞质，呈棕黄色或棕褐色颗粒。同时按照无着色计0分、黄色计1分、棕色计2分、棕褐色计3分的标准给阳性细胞染色强度计分。最后将阳性细胞百分比例与着色强度评分相乘得出最终表达评分，分为阳性表达（＞3分）和阴性表达（≤3分）。

1.3 统计学方法 采用χ2检验比较USP10、p14ARF蛋白表达情况等以率（%）表示的计数资料，卵巢上皮性癌患者的生存情况采用Kaplan-Meier法估计，影响卵巢上皮性癌患者预后因素采用单因素与多因素Cox回归模型分析探讨，双侧检验水准α为0.05，采用IBM公司SPSS 25.0软件进行分析。

2 结果

2.1 不同癌组织中USP10、p14ARF蛋白表达水平的比较 卵巢上皮性癌组织中USP10、p14ARF蛋白阳性表达率均明显低于非癌组织（35.00%vs 63.33%，P＜0.05；33.33%vs 61.67%，P＜0.05），见表1、图1-2。

图1 USP10蛋白在卵巢上皮性癌组织中的表达情况

表1 不同癌组织中USP10、p14ARF蛋白表达水平的比较[n（%）]

2.2 USP10、p14ARF蛋白表达和卵巢上皮性癌临床病理特征的关系 USP10、p14ARF蛋白表达与卵巢上皮性癌患者的年龄、肿瘤直径无明显差异（P＞0.05），但与上皮性卵巢癌的FIGO分期、有无淋巴结转移、有无腹腔积液有关（P＜0.05），见表2。

表2 USP10、p14ARF蛋白表达和卵巢上皮性癌临床病理特征的关系

图2 p14ARF蛋白在卵巢上皮性癌组织中的表达情况

2.3 卵巢上皮性癌患者的预后生存情况 本研究120例卵巢上皮性癌患者随访3～60个月，中位生存时间43个月。USP10阳性表达卵巢上皮性癌患者的中位生存时间明显高于阴性表达患者（55月vs 28月）（χ2=20.364，P＜0.001），p14ARF阳性表达卵巢上皮性癌患者的中位生存时间明显高于阴性表达患者（52月vs 29月）（χ2=20.415，P＜0.001）。

2.4 卵巢上皮性癌患者预后影响因素单因素分析有无淋巴结转移、FIGO分期、有无腹腔积液、USP10表达、p14ARF表达患者的生存时间均存在明显差异，且有淋巴转移、FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期、有腹腔积液、USP10阴性表达、p14ARF阴性表达患者的生存时间更短（P＜0.05），见表3。

2.5 卵巢上皮性癌患者预后影响因素多因素Cox回归分析 将表3中有意义的变量作为自变量，进行预后多因素Cox回归分析得出：FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴转移、腹腔积液、USP10阴性表达、p14ARF阴性表达均是影响卵巢上皮性癌患者预后危险因素（P<0.05），见表4。

表3 卵巢上皮性癌预后影响因素单因素分析结果

表4 卵巢上皮性癌患者预后影响因素经多因素Cox回归分析

3 讨论

卵巢癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一,其死亡率仅次宫颈癌，已成为当今困扰女性患者最大的妇科恶性肿瘤杀手[9]。其中上皮性卵巢癌是卵巢癌最常见的病理类型，其发病率居女性生殖系统恶性肿瘤第三位，该疾病具有早期症状不明显、发病隐匿、转移率与复发率高等特点，因此一旦确诊时大多患者已发展到中晚期[10]。既往也有统计发现，约70%上皮性卵巢癌患者被诊断时已处于晚期[11]。虽然随着医学科学水平的不断提高，卵巢癌标准术式和各种化疗药物及靶向药物已得到不断完善，但术后患者5年生存率依然较低。既往有统计发现，上皮性卵巢癌5年生存率仅为46.2%[12]。因此，面对该现状，寻找上皮性卵巢癌预后指标对于卵巢癌生存率的提高一直是妇科领域研究的难题。

而本次研究分析卵巢上皮性癌组织中USP10与p14ARF表达及临床预后意义，结果显示，卵巢上皮性癌组织中USP10、p14ARF蛋白阳性表达率均明显低于非癌组织（P<0.05），表示USP10、p14ARF在卵巢上皮性癌组织中表达降低，与疾病的生长、增殖关系密切。本研究结果显示，USP10、p14ARF蛋白表达与上皮性卵巢癌的FIGO分期、有无淋巴结转移、有无腹腔积液有关（P<0.05），且随着随肿瘤FIGO分期越高，有淋巴结转移、有腹腔积液，其表达下调，结果提示USP10、p14ARF蛋白蛋白的表达水平下调与上皮性卵巢癌的发生发展有关。本研究经随访以及单因素结果发现，USP10阴性表达、p14ARF阴性表达患者的生存时间更短（P＜0.05），表明USP10、p14ARF与卵巢上皮性癌预后生存时间密切相关。同时本研究经多因素Cox分析得出：USP10阴性表达、p14ARF阴性表达均是影响卵巢上皮性癌患者预后危险因素（P＜0.05），进一步证实USP10、p14ARF与肿瘤发生、进展以及预后密切相关，可能用作评估疾病预后生物标志物。USP10是泛素特异性蛋白酶（USPs）家族的成员之一，属于半胱氨酸蛋白酶，USP10作为一种重要的去泛素化酶，能够通过去泛素化作用稳定p53在细胞中的蛋白质水平，并达到调控细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、自噬等过程[13-14]。既往研究发现，USP10蛋白表达在宫颈鳞状细胞癌等多种肿瘤组织中下调[15]。p53是当前发现的与肿瘤密切相关的基因，当p53基因突变时，能够刺激肿瘤细胞恶化与增殖，既往有研究发现，p53蛋白在卵巢癌细胞中表达升高[16]。p14ARF是细胞周期依赖性激酶4抑制因子家族中的一员，作为细胞周期调控因子能够白主要与mdm2-p53复合体结合，阻断P53蛋白降解，延长P53蛋白的半衰期，从而诱导细胞周期停滞和凋亡[17-18]。当p14ARF蛋白在卵巢癌组织中表达降低，影响p53通路信号的传导，使其对卵巢癌细胞的生长抑制作用减弱，一定程度上促进了卵巢痛的发生、发展。

综上所述，卵巢上皮性癌组织中USP10、p14ARF的阴性表达率高，且二者表达均与患者FIGO分期、有无转移、有无腹腔积液有关，有望作为评估卵巢上皮性癌患者预后的有效生物标志物。