探讨PDCD4在稽留流产患者血清和绒毛与蜕膜组织中的表达及临床意义

郑媛媛，郑素娟

（1.登封市人民医院产科；2.登封市人民医院妇产科 河南 登封 452470）

稽留流产是自然流产的一种特殊形式，无需外界干预，稽留流产中胚胎死亡而仍稽留于宫腔内，且孕产物一般多在症状产生后1～2个月内排出[1]。稽留流产约占自然流产的15%到20%，且近年来呈上升趋势[2]。有关稽留流产的机制到目前为止并不明确，与母体染色体异常、内分泌失调、机体炎症反应和环境原因密切相关[3]。程序性细胞死亡因子4（programmed cell death 4，PDCD4）是在凋亡过程中被上调的基因，近年来研究发现PDCD4是肿瘤抑制基因，在多种肿瘤细胞（肝细胞癌、侵袭性乳腺癌、人胶质瘤、和鼻咽癌等）的增殖、侵袭和转移中起着重要的作用[4]。同时PDCD4还参与机体炎症反应，microRNA-16（miR-16）靶向PDCD4可能通过动脉粥样硬化中的有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子-kB（NF-kB）信号传导抑制炎性巨噬细胞的活化[5]。PDCD4缺乏会加速脂多糖/D-半乳糖胺（LPS/D-GalN）诱导的急性肝损伤，结肠炎以及与结肠炎相关的结直肠癌，并明显上调促炎性细胞因子（如IL-6）的表达，表明PDCD4作为抗炎因子的潜在作用[6-7]。目前，对稽留流产患者血清、绒毛与蜕膜组织中PDCD4水平的检测报道很少，而本研究拟通过测定稽留流产患者血清、绒毛与蜕膜组织中PDCD4水平，并分析其与血清炎症因子及激素水平的关系，这在国内外比较少见，将为稽留流产发生机制的探讨提供依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2018年2月至2019年12月本院妇产科稽留流产患者40例为病例组，同期终止妊娠的健康早孕妇女40例为对照组。研究对象自愿提供血清及绒毛与蜕膜组织用于待测。本研究得到了本院伦理委员会的批准，并获得患者知情同意书。病例纳入标准：⑴符合稽留流产或早孕终止妊娠标准[8]；⑵年龄＞18岁。排除标准：⑴采用辅助生殖技术受孕者；⑵近3个月有手术者；⑶合并心脏病或高血压者；⑷早产胎膜破裂者；⑸前置胎盘或产前出血妇女。

1.2 方法

1.2.1 血清、绒毛蜕膜组织PDCD4 mRNA表达水平测定 使用TRIzol试剂（上海圣贡生物技术有限公司）从组织，血清中提取总RNA。经过浓缩，纯度和完整性检测后，将1μg经DNase I处理的RNA与用于RT-qPCR试剂盒的Hieff First Strand cDNA Synthesis Super Mix（Yeasen Biotech，Shanghai）进行逆转录反应。使用Hieff qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒（Yeasen Biotech，上海）在ABI Prism 7300序列检测系统（Applied Biosystems，CA）上进行定量PCR分析。引物序列如下：PDCD4正向：5′-GCAAAGGGACGTCGGAGA-3′，反 向：5′-TCCAGGTTGTGCAGGTTGTT-3′，GAPDH蛋 白 正向：5′-CATTCCAAATATGAGATGCGTTGT-3′，反向：5′-TGTGGACTTGGGAGAGGACT-3′。根据检测到的基因/样品，将甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）蛋白用作内源性对照。反应条件如下：52℃3 min；94℃12 min，93℃30 s，60℃1 min（40个循环）。反应体系为：正向引物10μl、反向引物10μl、RNA模版0.6μl、超级酶混合物0.2μl、2×μByr。通过使用2-ΔΔCt方法计算相对表达水平。

1.2.2 血清、绒毛蜕膜组织PDCD4蛋白表达水平测定 用裂解缓冲液提取血清、绒毛蜕膜组织中蛋白质，使用BCA蛋白质测定试剂盒（均来自中国江苏海门的Beyotime生物技术研究所）来测定蛋白质浓度。采用免疫印迹分析（Western blot法）将蛋白裂解物在12%SDS-PAGE凝胶上分离，然后转移到PVDF膜上（Millipore，Billerica，MA，USA），再用5%的脱脂奶粉封闭该膜。接下来，将膜与兔抗PDCD4单 克 隆 抗 体（ab6721；Abcam，Cambridge，MA，USA）以及GAPDH（ProteinTech，Chicago，IL，USA）孵育过夜，再用Tween的Tris缓冲盐水（TBST）洗涤四次，并与辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔二抗培养2 h。采取增强的化学发光（ECL）试剂（Pierce，Rockford，IL，美国）来显示蛋白条带。

1.2.3 血清中TNF-α、雌二醇、孕酮水平测定TNF-α、雌二醇、孕酮采用ELISA法测定，试剂盒购于武汉华美生物科技有限公司 （批号：ZW54896.63、XW1258.63、BGA52478.63）。 按 照ELISA试剂盒说明书进行相应检测操作。

1.3 统计分析 采用SPSS19.0对数据进行录入、统计学分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示，采用t检验比较；采用Pearson相关性分析探讨变量之间相关性，检验水准α为0.05。

2 结果

2.1 两组一般情况比较 两组年龄、BMI、妊娠周数、TG、HDL-C、LDL-C等一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 两组一般情况比较

2.2 两组血清、绒毛蜕膜组织PDCD4 mRNA和蛋白水平比较 病例组血清、绒毛蜕膜组织PDCD4 mRNA水平低于对照组，病例组血清、绒毛蜕膜组织PDCD4蛋白水平低于对照组，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。见表2、图1。

表2 两组血清、绒毛蜕膜组织PDCD4 mRNA和蛋白水平表达

图1 各组血清、绒毛蜕膜组织PDCD4蛋白电泳图

2.3 两组血清TNF-α、雌二醇、孕酮水平比较 表3所见，病例组血清TNF-α水平高于对照组，雌二醇、孕酮水平低于对照组（P＜0.05）。见表3。

表3 两组血清TNF-α、雌二醇、孕酮水平比较

2.4 各变量相关分析 血清、绒毛蜕膜组织PDCD4 mRNA和蛋白水平与血清TNF-α负相关，与血清雌二醇、孕酮正相关（P＜0.05）。见表4。

表4 各变量的相关分析

3 讨论

PDCD4最初是一个与凋亡相关的基因，后来被鉴定为抑癌基因。同时，它还参与了一些急性和慢性炎症性疾病，例如动脉粥样硬化、饮食引起的肥胖、LPS/D-GalN引起的急性肝损伤、结肠炎等[9]。绒毛被称为母体子宫组织，它在保护胚胎免受母体免疫细胞攻击中起着至关重要的作用，并为胎盘形成之前的胚胎发育提供营养支持。有研究报道，类维生素A-干扰素引起的绒毛组织发育不良与新生血管抑制导致的流产有关，在流产的绒毛样样品中发现血管内皮生长因子（VEGF）的表达下调，提示VEGF可能在稽留流产中起重要作用[10-11]。PDCD4与VEGF具有类似的促进血管生成功能[12]。本研究中qRT-PCR和Western blot的结果显示，病例组血清，绒毛蜕膜组织PDCD4 mRNA和蛋白水平低于对照组，这说明，低水平的PDCD4可能导致了绒毛蜕膜组织血管发育不良进而诱导稽留流产。

本研究检测了TNF-α的表达，结果显示流产患者TNF-α水平较高，进一步采用Pearson相关分析血清、绒毛蜕膜组织PDCD4与TNF-α水平的相关性，提示PDCD4的表达与TNF-α之间正相关；这也说明PDCD4在稽留流产炎症反应的机制还有待进一步研究。细胞因子在维持胎儿和母体免疫系统之间的体内平衡方面起着重要作用，如果打破这种微妙的平衡，则免疫调节机制可能不足以恢复体内稳态，并可能导致妊娠失败[13-14]。既往研究表明PDCD4通过影响细胞因子（如TNFα、IL-12）的分泌而参与炎症相关性疾病[15]。

本研究检测了母体中血清雌二醇和孕酮的水平，结果表明，病例组血清雌二醇、孕酮水平低于对照组，这些结果表明正常雌二醇和孕酮与健康怀孕的发展和保护有关。分析认为，成功怀孕期间，蜕膜化是一个关键过程（子宫内膜基质细胞分化为蜕膜基质细胞），这种转化受雌激素和孕激素等激素控制，并协调胚胎着床和胎盘的形成。这对于实现母体对同种异体胎儿的免疫耐受也起着决定性作用[16]。此外，采用Pearson相关性分析在稽留流产患者中，雌二醇水平低与调节性T细胞（Treg）细胞水平下降和炎症因子IL-4产生呈正相关，这也再一次提示炎症反应在稽留流产中的重要作用。本研究也发现，血清、绒毛蜕膜组织PDCD4 mRNA蛋白水平与血清雌二醇、孕酮正相关。体外细胞实验黄体酮可以下调子宫内膜癌细胞和原代子宫内膜细胞中PDCD4的表达[17-18]。本研究中，与对照组相比，稽留流产患者血清中孕酮水平低，稽留流产蜕膜组织中PDCD4表达降低，这提示稽留流产患者中PDCD4的下调与低水平孕酮相关，但其机制仍需进一步研究阐明。

综上所述，稽留流产患者血清、绒毛与蜕膜组织PDCD4表达水平降低；PDCD4与稽留流产患者炎症反应及激素水平紊乱有相关性，这可能是稽留流产的机制之一。