枯草芽孢杆菌在番茄病害防治上的应用与研究进展

甘金佳，毛玲莉，孙成荣，潘美学，蒋水元

（1.广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所，桂林，541006；2.桂林市农业科学研究中心；3.广西资源县生产力促进中心；4.广西资源县车田苗族乡农业服务中心）

番茄病害种类繁多，其中，灰霉病、青枯病、疫病、立枯病、枯萎病和根腐病等病害发生较为普遍。半个多世纪以来，化学农药在防治番茄病害方面发挥了十分重要的作用，但长期、连续和不合理地使用，造成病原菌产生抗性、农产品化学残留及环境污染等一系列问题，不仅严重制约了番茄产业的可持续发展，还威胁着人类健康，这就促使人们探寻一种对人类和环境均友好并具有良好防治效果的新的植物病虫害防治策略[1～3]。

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种广泛分布于各种不同生活环境中的嗜温性好氧革兰氏阳性杆状细菌，可以产生内生芽孢，耐热、抗逆性强，在土壤和植物的表面普遍存在，同时还是植物体内 常见的一种内生菌，对人畜无毒无害，不污染环境。由于它生长速度快、营养需求简单，在植物的表面易于存活、定殖与繁殖，而且生产枯草芽孢杆菌制剂的工艺简单，制剂稳定，施用方便，储存期长，所以是一种理想的番茄病害生防微生物[3]。

1 枯草芽孢杆菌的生防机制

枯草芽孢杆菌的生防作用机制多种多样，概括起来主要有竞争、拮抗、溶菌、诱导植物抗病性和促进植物生长等几个方面。

1.1 竞争作用

主要包括营养竞争和位点竞争。营养和空间位点的竞争是指存在于同一微小生物环境中的2个或2个以上微生物之间争夺这一环境内的空间、营养、氧气等的现象。枯草芽孢杆菌具有较强的竞争和定殖能力，从而抢占病原菌的侵染位点，消耗其周围养分，阻止和干扰病原菌对植物叶面和其他器官的侵染，起到防病抑菌的作用[3]。

1.2 拮抗作用

是指微生物通过同化作用产生抗菌物质抑制有害病原物的生长或发展或直接杀灭病原物。产生的拮抗物质主要有抗生素、细菌素、细胞壁降解酶类和其他抗菌蛋白及挥发性抗菌物质[4]。

1.3 溶菌作用

是指拮抗微生物通过吸附在病原真菌的菌丝上，并随着菌丝生长而生长，产生溶菌物质消解菌丝体，使菌丝发生断裂、解体、细胞质消解，有的菌丝原生质凝结；或者是次生代谢产物对病原菌孢子的细胞壁产生溶解作用，致使细胞壁产生穿孔、畸形等现象[2]。

1.4 诱导植物产生抗性

枯草芽孢杆菌不但能直接抑制植物病原菌，而且能通过诱发植物自身的抗病潜能来增强植物的抗病性。近年研究表明，一些病原菌进入免疫植株的穿入能力因免疫植株抑制其发育、侵入和增殖而明显降低[5]。

1.5 促进植物生长

在植物根际生活的一类具有刺激植物生长和抑制植物病原菌等综合作用的细菌群叫促进植物生长根际细菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）。1998年发现生防枯草芽孢杆菌能促进植物根系及植株生长，增强植物的抗病性，从而间接减少病害发生[5]。

2 枯草芽孢杆菌在番茄病害防治上的应用

国内外使用芽孢杆菌防治植物病害非常广泛，尤其是枯草芽孢杆菌。其因安全性高、能产生多种抗菌物质而受到生物防治工作者的偏爱。目前已有很多优良的枯草芽孢杆菌菌株在番茄病害防治上进行应用，例如，日本东京技术研究所的枯草芽孢杆菌RB14和NB22分别对Rhizoctonia solani、Fusarium orysporum和Pseudomonas solanacearum引起的番茄病害有良好的防效[6]。我国利用枯草芽孢杆菌防治番茄病害的应用研究也达到了世界先进水平[2]，已有学者开展利用枯草芽孢杆菌防治番茄灰霉病、青枯病、早疫病、立枯病、枯萎病、根腐病、匍柄霉叶斑病、棒孢叶斑病和茎基腐病等病害的研究。

2.1 枯草芽孢杆菌在番茄灰霉病防治上的应用

番茄灰霉病是由半知菌亚门灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）引起的重要病害，可为害番茄的茎、叶、花和果实，影响番茄的产量和品质。近年来，保护地番茄种植面积不断扩大，为灰霉病菌在保护地土壤中大量累积及侵染植株提供了有利的小环境，特别是冬春季节棚室中低温、高湿的气候条件，更利于灰霉病的发生，通常造成番茄减产20%～30%，严重时可达60%[7]。早在2001年，Utkhede等[8]就发现枯草芽孢杆菌具有防治番茄灰霉病和提高番茄果实产量的潜力，可挽回温室番茄生产中因番茄茎伤感染灰霉病导致的经济损失。Hinarejos等[9]发现，枯草芽孢杆菌IAB/BS03菌株是一种有效的生物防治剂，喷施于番茄叶面后可以降低番茄灰霉病发病率。而On等[10]发现，亚麻芽孢杆菌/枯草芽孢杆菌联合施用一般比单独施用对番茄灰霉病菌更有抑制作用，在菌株提取物中发现了包括表面活性剂在内的抗真菌化合物，表明抗生物活性是其主要作用机制。

国内学者应用枯草芽孢杆菌防治番茄灰霉病的研究也比较早，杜立新等[11]研究发现，枯草芽孢杆菌BS-208和BS-209制剂对番茄灰霉病均具有良好的防治效果，其防效随浓度加大而提高，以800倍液的防效最好，两菌株制剂800倍液连续3次施药后防效均在74%以上，并且BS-208菌株的防效略高于BS-209菌株。侯晓丹等[12]对枯草芽孢杆菌进行了磁场诱变，获得3株高效拮抗菌，利用注射接种法对番茄灰霉病菌拮抗作用进行研究，发现先接种BS1.25的处理防效达100%，显著好于对照，为较理想的拮抗菌。枯草芽孢杆菌菌剂可以与其他菌剂或者农药混合使用，徐升运等[13]分别研究了枯草芽孢杆菌M6、木霉10和两者配成的复合菌剂对番茄灰霉病的防治效果，田间防治结果表明，复合菌剂对番茄灰霉病的防治效果良好，随浓度的增加防效不断提高，以800倍液的防效最好，连续2次施药后防效在80%以上。纪明山等[14]发现，1.8%阿维菌素乳油与枯草芽孢杆菌B36可湿性粉剂混用可以明显提高其防治番茄灰霉病的药效，其预防效果与治疗效果分别提高2.59个百分点与5.84个百分点。目前，我国在开发利用枯草芽孢杆菌防治植物病害方面已取得一定成绩，现有部分商品制剂（主要是可湿性粉剂和水剂）开发成功并投入生产应用，刘晓刚等[15]结果表明，1 000亿活芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对番茄灰霉病叶片和果实防治效果达到83.16%和89.28%；乔岩等[7]的活体盆栽试验结果表明，枯草芽孢杆菌菌剂对番茄灰霉病兼有预防和治疗作用，最高用量预防效果为75.62%，治疗效果为68.75%，预防效果优于治疗效果。原丽等[16]发现枯草芽孢杆菌对番茄苗期灰霉病有较好的防效，且抑菌强度与枯草芽孢杆菌浓度呈正相关，其防效在第14天时可达60.5%，明显高于对照。尉文彬等[17]的试验结果表明，枯草芽孢杆菌是灰霉病的有效防治制剂，枯草芽孢杆菌250倍液对番茄灰霉病的防治效果可达到74.73%，建议在整个生长季共喷药3次，每次用药间隔7 d。乔俊卿等[18]研究了枯草芽孢杆菌PTS-394灌根对灰霉病的防治效果，菌株PTS-394灌根番茄后48 h，离体叶片接种番茄灰霉菌病菌，结果显示，菌株PTS-394处理的番茄叶片病斑面积仅为对照的50%，防控效果达47.1%；盆栽试验显示，菌株PTS-394处理后对番茄灰霉的防治效果为58.2%。综上所述，利用枯草芽孢杆菌菌剂对番茄灌根或喷雾后，可以触发番茄植株系统性的抗病性产生，增强植株免疫能力。

2.2 枯草芽孢杆菌在番茄青枯病防治上的应用

番茄青枯病是由茄青枯拉尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一种毁灭性土传病害，目前对该病的防治尚无理想药剂和抗病品种，因此利用有益微生物防治该病具有广泛的发展前景[19]。日本学者Phae等[20]发现枯草芽孢杆菌菌株NB22对番茄根腐病和青枯病都有良好的防治效果。Singh等[21]发现，0.01%的次氯酸钙和枯草芽孢杆菌联合施用可以有效降低番茄青枯病的发病率。Shiva等[22]发现枯草芽孢杆菌对番茄青枯病具有84%的防治效果，如果与木霉和荧光假单胞菌联合施用，可提高对番茄青枯病的防治效果。

Algam等[23]发现，枯草芽孢杆菌拮抗菌株不仅是良好的促生剂，也是有效的抗性诱导剂，用枯草芽孢杆菌处理番茄种子能够有效控制番茄青枯病，防治效果为80%，充分显示了枯草芽孢杆菌在番茄青枯病治理上的潜在重要性。黎起秦等[19]用注射法先接种枯草芽孢杆菌B47菌株后接种病原菌的试验取得92.10%的防效，将枯草芽孢杆菌B47菌株和番茄青枯病菌混合施入土壤后，随B47数量增加番茄青枯病菌的数量显著降低，接种后第20天，对番茄青枯病的防治效果达79.79%[24]。乔俊卿等[25]发现，利用枯草芽孢杆菌Bs916灌根处理番茄后14 d，对番茄青枯病的防治效果为55.6%，而连玲丽等[26]发现枯草芽孢杆菌SB1对番茄青枯病的防治效果达77.78%。由此可见，枯草芽孢杆菌不同菌株对番茄青枯病的防治效果不尽相同。枯草芽孢杆菌商品制剂也已应用于青枯病的防治上，黄永山等[27]研究发现，1亿孢子/mL枯草芽孢杆菌水剂300倍液、400倍液和500倍液对番茄青枯病的防效分别为91.29%、88.06%和84.41%。

2.3 枯草芽孢杆菌在番茄早疫病防治上的应用

番茄早疫病又称轮纹病，是发生在番茄茎叶果实上的重要病害之一，其病原真菌（Alternaria solani）除了侵染番茄以外，还为害马铃薯、茄子、辣椒等，一般年份可导致番茄产量损失10%～30%，流行年份损失可达30%～40%[28]。Abbasi等[29]研究表明，枯草芽孢杆菌QST713与氢氧化铜制剂联合喷施于番茄叶片，可以有效降低番茄早疫病为害程度。Chowdappa等[30]研究了枯草芽孢杆菌OTPB1菌株对番茄早疫病菌的植株体外抗菌、生长刺激和诱导番茄幼苗系统抗早疫病的效果，结果表明，OTPB1处理提高了番茄植株与防御相关酶的水平，包括过氧化物酶、多酚氧化酶和超氧化物歧化酶，研究还表明，OTPB1在促进植株生长和抗性的同时，通过诱导产生生长激素和防御酶，增强了番茄幼苗的系统抗性。Awan等[31]探讨枯草芽孢杆菌单独及联合植物营养物质（氮、磷、钾、锌、镁等）对番茄早疫病的生物防治效果，结果表明，与在番茄叶面单独施用枯草芽孢杆菌相比，枯草芽孢杆菌与植物营养物质联合施用，对早疫病的防治效果可显著提高67%～83%，并使植株的生长特性提高20%～77%，表明微生物制剂和植物营养物质共同施用可形成正效应。Shoaib等[32]分离得到3株枯草芽孢杆菌，盆栽试验结果表明，叶面施用枯草芽孢杆菌（BS-01、BS-02和BS-03）可将早疫病的防治效果显著提高42%～92%，植株生长性状提高25%～165%，随着番茄总酚含量的增加，番茄植株抗氧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶和多酚氧化酶含量也上调继而诱发植株抗性。

杨冬静等[28]研究表明，枯草芽孢杆菌NJ-18发酵液喷施处理盆栽番茄苗后接种，14 d后对番茄早疫病的防治效果为72.9%，显著高于对照处理。李改玲等[33]研究发现，枯草芽孢杆菌QM3菌株可以产生抗菌物质和胞外水解酶，经显微直接观察发现，QM3菌株对病原菌丝有明显的抑制生长和致畸作用，此外，还有竞争生长空间和营养物质的趋势，这一结果揭示枯草芽孢杆菌是通过多种抗菌机制的协同作用有效抑制番茄早疫病菌的。胡青平等[34]发现，枯草芽孢杆菌QM3发酵液对番茄早疫病有明显的防治效果（p＜0.05），最高可达52.94%，且与化学农药联合使用防效更好，最高可达71.80%。马新等[35]制备枯草芽孢杆菌微囊剂并进行田间药效试验，结果表明，该枯草芽孢杆菌微囊剂用量为300 g/hm2（芽孢浓度为1.5×107cfu/m2）时，对番茄立枯病的防效最高，为72.76%。张晓琴等[36]从土壤中分离得到1株枯草芽孢杆菌YA-3菌株，发现其发酵液可使番茄叶片早疫病发病率显著降低，防治效果可达到75.52%，该拮抗菌的发现，为生物防治植物病害提供了新的、有效的生防资源，具有良好的应用前景。

2.4 枯草芽孢杆菌在番茄其他病害防治上的应用

番茄枯萎病、立枯病、根腐病以及其他病害发生也较为普遍，番茄枯萎病是由枯萎病菌（Fusarium oxysporum）引起的一种严重为害番茄品质和产量的土传病害，番茄从幼苗期到成株期均易受到枯萎病菌的感染[37]。利用枯草根菌进行番茄枯萎病的生物防治很有前途，在农业可持续发展中可能发挥重要作用。Solanki等[38]发现，枯草芽孢杆菌菌株MB101在番茄根系上具有较高的定殖度，施用枯草芽孢杆菌能提高番茄植株的株高、生物量和叶绿素含量，田间试验中，菌株MB101与菌株MB14及对照相比，枯萎病症状明显减轻，果实产量显著提高。Mohammed等[39]从发生番茄枯萎病的田间选出健康番茄植株并从其根部分离到52个菌株，在这52个菌株中只有2个菌株对枯萎病菌有拮抗作用，即假单胞菌和枯草基菌。刘邮洲等[37]研究发现，枯草芽孢杆菌sf628对枯萎病菌的防效为91.46%。而陈雪丽等[40]的盆栽试验表明，枯草芽孢杆菌菌悬液及其无菌代谢物对番茄枯萎病具有较好的防治效果，防效可达68.42%，而且具有明显的促进生长作用。

番茄立枯病的病原菌为立枯丝核菌（Rhizoctonia solani），是一种为害严重的真菌，可侵染番茄、水稻、棉花、瓜果等多种农作物[41]。Szczech等[42]研究了枯草芽孢杆菌RB14-C（产生抗生素iturin A）作为生物防治剂的有效性，通过种皮或直接将枯草芽孢杆菌引入土壤来防治番茄立枯病病原菌的感染，发现，种子包衣和联合处理（土壤和种子用RB14-C处理）不能保护幼苗免受病原菌R.solani引起的侵染，相比之下，仅将RB14施入土壤就能控制立枯病病害。马新等[41]的田间药效试验表明，枯草芽孢杆菌可有效防治番茄立枯病，当微囊剂用量为300 g/hm2（芽孢浓度为1.5×107cfu/m2）时防效为72.76%。

根腐病是加工番茄主产区发生非常普遍的病害，平均发病率在30%～40%，严重地块出现大面积植株枯死[43]。根腐病由Pythiuma phanidermatum引起，侯彩霞等[43]发现，枯草芽孢杆菌菌株对加工番茄根腐病有较好的防治作用，防效可达69.02%，还可以提高番茄产量，防治根腐病的主要机理是抑制病原菌菌丝生长和促进加工番茄植株体内多酚氧化酶、过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性的提高。王震等[44]的研究结果表明，10亿芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂通过育苗期田间滴灌综合应用能显著改善番茄植株生长发育状况和提高产量，对番茄根腐病防治效果显著，防效达到66.7%，具有良好的应用价值，为有机番茄高产提供了重要技术支撑。

番茄棒孢叶斑病是由多主棒孢（Corynespora cassiicola）引起的一种重要病害，在世界多数番茄种植区域都有发生，近年来传入我国，对我国番茄生产造成了严重的影响[45]。黄大野等[45]采用活体盆栽试验研究其对番茄棒孢叶斑病的防治效果，结果表明，枯草芽孢杆菌NBF809菌株对番茄棒孢叶斑病的防治效果达到73.26%。

番茄匍柄霉叶斑病由茄匍柄霉（Stemphylium solani）和番茄匍柄霉（Stemphylium lycopersici）引起，其中茄匍柄霉是主要病原菌，番茄匍柄霉叶斑病主要为害番茄的叶片、茎蔓和果实，全生育期均可发病，从局部发病到全株感染只需要2～3 d，防治难度较大[46]。李新宇等[46]的番茄盆栽试验结果表明，枯草芽孢杆菌菌株ZF161对番茄匍柄霉叶斑病的防治效果达到63.27%，菌株ZF161对番茄匍柄霉叶斑病具有良好的防治效果，且可抑制多种病原真菌，具有开发应用的潜力。

3 枯草芽孢杆菌在番茄病害生防中存在问题、解决措施

枯草芽孢杆菌在番茄病害生防的研究及开发应用方面已取得了令人瞩目的成就，但其发展过程中仍存在不少问题，如枯草芽孢杆菌在番茄同一病害中的防治效果大不相同，其原因可能是田间条件下，枯草芽孢杆菌易受土壤温湿度、pH值、作物生长状况及土壤生态系统等微环境因素的影响，生长不稳定，分泌的有效杀菌物质被降解，因此防治效果不稳定。为解决这一问题，目前主要采用与化学农药复配和与其他拮抗微生物协同防病这2种措施[3]。

使用化学农药复配防病目的是帮助枯草芽孢杆菌克服在土壤生态环境里定殖过程中与其他微生物群落的竞争，形成优势种群，使之有足够的群体数量来克服包括病原菌在内的土壤习居微生物的排斥作用，保持其在植物根、叶周围定殖，分泌抗生素，诱导植物抗病性等作用，同时发挥化学药剂杀虫抑菌速度快、防治效果稳定的优势，通过复配协同作用达到优势互补、用量减少、防效增强的目的[2，3]。

与其他拮抗微生物协同防病，是将互容的2种以上的拮抗微生物（混用的不同抗生菌之间没有拮抗、寄生、溶解或竞争等互斥关系）混合，将有利于混合菌株对植物不同部位的空间全面占领，由于混合菌剂能适应不同环境条件，可在更大的光、温、气、湿度变幅内生存繁衍，因此有望实现多种抗生菌功能互补、多种病害兼防、作用持久的协同防治效果[2，3]。

4 枯草芽孢杆菌在番茄病害防治上的研究趋势与展望

目前关于枯草芽孢杆菌在番茄病害防控上的应用研究发展迅速且取得了阶段性成果，今后可从以下几个方面进行下一步的研究，枯草芽孢杆菌对番茄病害的生防作用研究及其开发应用也会出现新的发展。

4.1 利用分子生物学技术培育枯草芽孢杆菌优良菌株

随着现代生物技术的广泛应用，基因组学和蛋白组学的发展，以及先进的仪器设备的应用[47]，特别是利用先进的CRISPR-Cas9基因编辑技术对枯草芽孢杆菌在基因水平上进行改造，获得优良菌株以提高研究效率，可能会对今后枯草芽孢杆菌在番茄及其他作物上的应用发展起到十分重要的作用[48]。

4.2 枯草芽孢杆菌与番茄、有机肥及耕作制度的协同

土壤微生物生物量、土壤酶的活性及作为植物生长必需的三大营养元素氮、磷、钾的含量均是评价土壤肥力的指标。微生物功能的发挥除受环境的制约外，番茄种类、有机肥及耕作制度等，也是影响其功能发挥的重要因素。未来可以在协调枯草芽孢杆菌与番茄、有机肥及耕作制度间的关系，发挥其在改良土壤、促进番茄生长等领域开展相关研究[49]。

由于枯草芽孢杆菌能产生耐热的芽孢，既易于生产、剂型加工，又易于存活、定殖与繁殖；批量生产工艺简单，成本也较低，施用方便，储存期长，而且其制剂稳定、与化学农药相容[50]，具有对人畜相对安全、环境兼容性好、不易产生抗药性等优点，所以随着经济的发展和人们认识的提高，其将在防治番茄病害中发挥更为重要的作用[3]。