新型冠状病毒检测试剂质量把控要点

【作 者】邓敏

上海市医疗器械检验研究院，上海市，201318

0 引言

2019年12月以来，湖北省武汉市出现新型冠状病毒肺炎疫情，随疫情蔓延，我国其他地区及境外多个国家也相继发现此类病例。该病作为急性呼吸道传染病已纳入《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病，按甲类传染病管理[1]。2020年2月11日，世界卫生组织将新型冠状病毒肺炎命名为COVID-19，国际病毒分类学委员会的冠状病毒研究小组建议把新型冠状病毒命名为SARS-CoV-2（严重急性呼吸综合征冠状病毒）[2]。新型冠状病毒属于β属的冠状病毒，基因组为线性的单股正链RNA，是已知可感染人类的第7种冠状病毒[3]，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60～140 nm[1]。可引起人类呼吸道感染，其基因特征与严重急性呼吸综合征（SARS）相关冠状病毒和中东呼吸综合征(MERS)相关冠状病毒有明显区别，基因组序列约由29 kb碱基对构成，拥有10个基因，可有效编码10个蛋白[4]。此次由SARS-CoV-2引起COVID-19疫情具有传染性强、传播迅速等特点，对该病毒进行快速、准确的实验室检测有利于有效控制疫情发展及对病患的及时诊治。疫情爆发以来，由于时间紧迫，研发任务紧急，已上市的产品存在质量上的不足。为提升试剂产品的性能，以便其更好地在疫情防控中发挥作用，本研究结合注册检验过程中发现的问题，从检验角度着重分析可能影响产品性能和质量的把控要点，并提出相关建议，为今后SARS-CoV-2实验室检测试剂的研发工作提供参考与思路。

1 新型冠状病毒肺炎的实验室检测方法

目前，针对新型冠状病毒肺炎的实验室检测方法主要分为病原学方法及血清学方法。病原学检测主要为核酸检测法，检测原理是检测患者体液样品中SARS-CoV-2特异性RNA序列。目前上市的核酸检测试剂均采用新型冠状病毒基因组中ORF1ab、E蛋白和N蛋白进行选择。不同产品的检测原理基本一致，主要区别在于其设计的引物和探针，二重检测的靶基因主要是双靶区段（ORF1ab、N基因）、三重检测的靶基因主要是三靶区段（ORF1ab、N基因和E基因）。核酸检测方法包括基因测序法、实时荧光定量PCR法、微滴式数字PCR法和恒温扩增芯片法等技术。最常用的是实时荧光PCR法，具有高特异性、高灵敏度的特点，是一种快速、成本较低且已在临床广泛使用的感染性病原体核酸检测技术。对实验室人员的操作能力、仪器设备要求较高。

血清学方法检测原理基于免疫学抗体检测，是检测新型冠状病毒进入人体后所产生的特异性抗体。方法包括：免疫层析法、酶联免疫吸法及化学发光免疫分析法等。已上市的抗体检测试剂主要针对检测抗体IgM、抗体IgG及总抗体。抗体IgM是机体受到病原体的攻击后人体初次体液免疫应答出现的抗体，是最先产生并迅速到达峰值的抗体，可用于早期诊断。抗体IgG产生较晚，但在血清中浓度较高、亲和力水平高，存在时间久，即使患者恢复后其浓度仍可保持较高水平，可被用于提示感染处于中后期或既往感染。与核酸检测相比，病毒抗体检测对临床实验室的操作要求相对要低，而且抗体血清学检测的样本来源于外周血、血清或血浆，具有良好的稳定性，从而可以提高检测的敏感度。且血液样本更易获得，采集操作简单快速，降低了医护人员在样本采集和检测过程中被感染的概率。抗体检测具有速度快、通量高的特点，更易于在基层实验室进行。但在人群流行率总体很低的情况下，病毒抗体检测不适用于大面积复工、复产、复学等普通人群的筛查工作，也不适用于在低流行地区进行流行病学的调查[5]。

核酸检测病毒的RNA，是病毒存在的直接证据，而机体感染病毒后产生体液免疫应答，产生的抗体就是病毒存在间接证据，可以判断患者是否近期或既往感染过2019新型冠状病毒。国家卫生健康委员会（卫健委）组织专家制定前六版《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》中都以病原学方法，如实时荧光RT-PCR检测和病毒基因测序作为诊断标准。而在2020年3月3日卫健委发布《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第七版）》（以下简称《诊疗方案第七版》）中明确指出诊断标准在原有病原学方法基础上，又增加“血清学检查”作为诊断新型冠状病毒肺炎判定的依据，即“血清新型冠状病毒特异性IgM抗体和IgG抗体阳性”或“血清新型冠状病毒特异性IgG抗体由阴性转为阳性或恢复期较急性期4倍以及以上升高”也可确诊[1]。《诊疗方案第七版》中也增加疑似病例排除标准，即疑似病例排除必须满连续两次新型冠状病毒核酸检测阴性（采样时间至少间隔24 h），且发病7 d后的新型冠状病毒特异性抗体IgM和IgG仍然阴性[1]。病毒核酸检测仍然是新型冠状病毒肺炎确诊感染的“金标准”，而抗体检测可以作为病毒核酸检测的有效补充。

2 2019新型冠状病毒检测试剂盒上市情况

截至2020年7月16日，已有44个新型冠状病毒检测试剂盒经国家药监局审批上市，均为定性检测试剂。基于病原学检查的新型冠状病毒（2019-nCoV）核酸检测试剂盒共计23个，其中16个荧光PCR法试剂、1个联合探针锚定聚合测序法试剂、1个恒温扩增芯片法试剂、1个杂交捕获免疫荧光法试剂、1个恒温扩增-实时荧光法试剂、1个RNA捕获探针法试剂、1个RNA恒温扩增-金探针层析法试剂及1个双扩增法试剂。新型冠状病毒（2019-nCoV）抗体检测试剂盒共计21个，其中包括8个免疫层析试剂、11个化学发光法试剂、1个量子点荧光免疫法试剂、1个酶联免疫法试剂。

3 2019新型冠状病毒检测试剂盒产品性能质量控制要点

2020年2月8日，科技部发布《科技部关于发布新型冠状病毒(2019-nCoV)现场快速检测产品研发应急项目申报指南》（后简称《申报指南》），面向社会征集更加快速、便捷、准确的新型冠状病毒的现场快速检测产品。企业纷纷响应国家政策号召，积极参与到SARSCoV-2检测试剂的研发生产活动中来。但由于SARS-CoV-2是新发病毒，故在研发生产过程中存在诸多难题，如：时间紧迫、相关技术把控要点掌握不到位以及较难获得足够量的临床样本等。2020年2月12日，医疗器械技术审评中心发布了《2019新型冠状病毒核酸检测试剂注册技术审评要点（试行）》（简称《核酸审评要点》），并在13 d后发布了《2019新型冠状病毒抗原/抗体检测试剂注册技术审评要点（试行）》（简称《抗体审评要点》）。依据《审评要点》及其他已发布的相同方法学相关行业标准，结合检验过程中发现的问题，建议企业对研发过程中可能影响产品性能和质量的要点应予重点关注，如：阳性判断值确定、最低检测限确定与验证、交叉反应、精密度检测方法、企业参考品的设置与制备、不同样本类型的核酸提取方法/试剂验证、内源/外源物质干扰验证及血液样本灭活方式等。

3.1 核酸检测试剂性能质量控制要点

3.1.1 阳性判断值确定资料

由于目前该类试剂盒没有计量学溯源性，所以确定资料主要是指对申报产品病毒核酸检测的Ct值（结果判断的临界值）进行确认的资料。资料中样本来源应考虑尽可能多的因素，并选取具有代表性的样本。对所选择阳性判断值研究方法的合理性，灰区建立的基础、阈值设置的科学合理性进行阐述和验证。

3.1.2 最低检测限的确定及验证

最低检测限的确定及验证是评价产品性能的重要环节。因目前新型冠状病毒核酸检测试剂国家参考品均无量值定值，故企业在研发过程中无法通过国家参考品进行量值溯源，这就需要企业对最低检测限进行合理设定及验证。在进行最低检测限的确定时，应至少包含不同来源的三个具有代表性的2019新型冠状病毒的真实临床样本或含有该病毒RNA片段的假病毒颗粒，用适当基质进行系列梯度稀释，在最低检测限浓度水平进行验证，结果应达到90%～95%阳性检出率。采用科学的方法标定病毒滴度，进行最低检测限相关的量值研究，并且提供详细的病毒液滴度的验证结果。

3.1.3 交叉反应验证

交叉反应实验可以直接反应出试剂特异性方面的性能，特异性高的试剂可以减少假阳性样本的出现。试剂需在病毒和细菌感染的医学相关水平进行交叉反应的验证。《核酸审评要点》中列举了约50余种病毒和细菌种类，企业如无法获得全部种类的样本，建议至少在冠状病毒（HKU1、OC43、NL43、229E）、SARS冠状病毒、MERS冠状病毒、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等7个大类别中分别挑选代表病毒或细菌样本进行验证。其中对于难以获得真实样本的类型，如SARS、MERS可用假病毒替代。需提供所有用于交叉反应验证的病毒和细菌的来源、种属/型别和浓度确认等相关资料。

3.1.4 精密度检测方法

《核酸审评要点》中要求精密度性能验证需要多个临床样本，除模拟样本外，同时应包含若干临床样本，至少包含阴性样品、临界阳性样品、（中或强）阳性样品。精密度评价试验及注册检验过程中应包含核酸分离/纯化步骤。重复性参考品中应包括高、低两个浓度的样本，其中低浓度应为最低检出限附近的浓度。

3.1.5 企业参考品的设置与制备

2020年4月16日，中国食品药品检定研究院标准物质和标准化管理中心发布了《注册检验用体外诊断试剂国家标准品和参考品目录（第八期）》，目录中增加了6个新型冠状病毒抗体、抗原及核酸检测试剂相关的国家参考品，此批应急用国家参考品可用于评估各申报试剂的性能，但没有公布量值及计量溯源。

各企业应根据产品性能的实际情况，同时参照中国食品药品检定研究院的新型冠状病毒核酸检测试剂国家参考品设置企业内部参考品的项目及内容，包括阳性参考品、阴性参考品、检测限参考品、重复性参考品，且应不低于国家参考品要求。其中，阳性参考品应至少选取不同来源、不同滴度水平的5个病毒样本。阴性参考品则主要包含对交叉反应进行验证的样本。检测限参考品的浓度水平可等于或略高于最低检测限的水平。企业应对内部参考品的来源、型别鉴定、病毒滴度等信息进行精确的试验验证，并提交详细的方法、使用试剂、具体数据结果等验证资料。除SARS冠状病毒、MERS冠状病毒可采用假病毒外，参考品应均为临床真实样本。

3.1.6 不同样本类型的核酸提取方法/试剂验证

目前有多种样本类型，拭子材质、采集方法、样本采集量和采样时机等都与病毒载量密切相关，可直接影响到试剂的检出率。《诊疗方案第七版》中，明确病原学检查样本包括：鼻咽拭子、血液、痰和其他下呼吸道分泌物、粪便等标本[1]。《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南》中将标本采集种类做了进一步的细化，包括鼻咽拭子、鼻咽抽取物、呼吸道抽取物、深咳痰液、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、肺组织活检标本、眼结膜拭子及便标本，并对不同类型的样本分别有相应的采集及保存要求[6]。2020年7月21日，国务院应对新型冠状病毒肺炎疫情联防联控机制医疗救治组发布了《新冠病毒核酸筛查稀释混样检测》中，规定原则上不超过5个的咽拭子进行充分混合，形成混合待检样本。面对种类众多的样本类型，且包括混合样品，这就需要企业对于上述所有样本类型的核酸提取试剂/方法的提取效率、提取纯度等，有针对性地对样本的灭活/液化、加样体积和模板洗脱体积做研究验证，明确说明具体操作过程，并提供详细的验证资料。若提取过程中涉及配套使用的自动核酸提取仪，企业还需要提供核酸提取仪的相关注册证书、仪器使用说明书及配套提取试剂盒的使用说明书。从而确保检测体系具有可控性，提高试剂灵敏度，降低假阴性结果的出现，保证检测过程顺利进行。

3.2 抗体检测试剂性能质量控制要点

抗体检测质量控制要点与核酸检测基本一致，但考虑抗体检验容易受到样本溶血、纤维蛋白、细菌污染或患者自身抗体等因素的影响，容易造成假阳性。因此，内源/外源物质干扰验证及血液样本灭活方式对试剂的影响也需要企业进行合理验证。据薛雄燕等[7]报道，采用荧光免疫分析法检测SARS-CoV-IgM，灭活前结果为阴性的标本，灭活处理后所有检测结果均为阳性，阴性符合率为0，表明此方法不可采用56 ℃、30 min灭活处理后的样本进行检测。说明不同的灭活方法会影响抗体检测结果，企业应在试剂说明书中写明样本灭活方法，并加以验证。对于同时可检测IgM、IgG两种抗体的检测试剂盒，企业阳性参考品制备时要注意合理均匀分配两种抗体阳性样本的比例，且应包含有IgM、IgG两种抗体阳性的样本，也包含有IgM、IgG单独抗体阳性的样本。

4 建议

2019新型冠状病毒肺炎疫情的突发是对企业的研发能力、生产能力的一场巨大考验，也是对临床实验室的检测能力、安全防范的一次极大挑战。疫情在全球范围内蔓延造成了对SARSCoV-2检测试剂的巨大需求，研发生产出更加快速、便捷、准确的SARS-CoV-2检测试剂成为各个厂家研发的目标。疫情初期，对实验室检测结果出现假阳性、假阴性的质疑声不绝于耳，但检测过程中的各个环节都会影响检测结果的准确度，如：试剂质量、采用方式、样品质量、操作人员、仪器性能等。应急研发生产的试剂在质量方面可能存在差异，仍有待进一步进行验证及比对。但各个检测实验室应根据自身具体情况，制定建立完整、合理和科学的技术操作规程、生物安全防护管理制度、结果质量保证措施及结果报告的规范等，同时应对检测人员进行严格的培训与考核。各个检测实验室应针对不同仪器、人员、方法和试剂开展室间质评实验比对活动，确保最终结果的准确性和可靠性，以便更好地指导临床诊疗工作。在注册检验及审批过程中应加强质量把控，保证检验质量，提高检验效率，确保检验结果的准确可靠，从而确保上市产品的质量。随着技术的发展与研究的深入，病毒检测技术与方法日趋成熟完善，SARS-CoV-2检测试剂会更好地服务于临床，为做好常态化疫情防控工作提供强有力技术支撑。