脑源性神经营养因子及其受体在小鼠卵母细胞第一极体释放中的作用

李 娜 王朕华* 王 悦 井佳雨 伊克运 李相禹

1.河南省人民医院(郑州，450003)；2 .郑州大学人民医院；3.河南大学人民医院

成熟卵母细胞对于高质量受精卵的形成和胚胎的健康发育是至关重要的。在卵泡生长发育成熟过程中不仅下丘脑-垂体-卵巢轴发挥着重要的作用，同时卵巢中卵母细胞和颗粒细胞等通过自分泌和旁分泌双向交流的方式同样发挥着重要的作用。近年研究发现，存在于中枢神经系统的脑源性神经营养因子(BDNF)不仅对多种神经元的成活、生长和分化有重要功能，同时也在神经元以外的细胞发育过程中也发挥重要作用[1-3]。近年研究认为,BDNF及其受体酪氨酸蛋白激酶受体B(TrkB)在卵巢中表达[4]，但对BDNF及TrkB在卵母细胞释放第一极体中作用的研究少见。本研究利用基因芯片技术，探讨BDNF及TrkB在小鼠卵泡中的表达及其在卵母细胞释放第一极体中的作用。

1 材料与方法

1.1 试剂

BDNF和孕马血清促性腺激素(PMSG)购自艾美捷科技有限公司，注射用绒毛膜促性腺激素(hCG)购自丽珠集团丽珠制药厂。Trizol试剂购自Reagent,Invitrogen公司，纯化试剂盒购自RNeasy Mini kit，Qiagen公司；实时定量荧光PCR(RT-PCR)试剂由南京瑞源生物技术有限公司提供，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)蛋白购自西安齐岳生物科技有限公司。

1.2 实验动物

来自中科院上海动物中心的未发育成熟的21日龄雌性B6D2F1小鼠，体重20～25g,按三级动物要求饲养。

1.3 方法

1.3.1模拟卵泡发育成熟和排卵每只小鼠注射7.5U PMSG[PMSG中含有活性的卵泡刺激素(FSH)和黄体生成激素(LH)，但以FSH作用为主]促卵泡发育；48h后注射5U注射用hCG促卵泡成熟和排卵。

1.3.2基因芯片分析、RT-PCR法检测卵巢组织中TrkB和BDNF表达72只21日龄的B6D2F1小鼠每只注射7.5U PMSG后，每2h处死1组小鼠(每组2只)，取小鼠双侧卵巢组织；48h后将剩下的24只小鼠每只小鼠腹腔注射5U hCG后，每1h处死1组老鼠(每组2只)，取卵巢组织。应用Trizol试剂提取总RNA并用总RNA纯化试剂盒进行纯化, 然后与Affymetrix小鼠MGU74v2芯片A、B、C杂交，芯片扫描获得的大量数据由Affymetrix Expression Console Software Version 1.0软件分析处理。①在立体显微镜下用注射器抽吸卵泡内含有稍许细胞碎片的卵泡液加入适量的培养液离心洗涤2次获得颗粒细胞；采用卵泡穿刺法分离卵丘细胞和卵母细胞获得后粉碎加入Trizol，严格按照Trizol试验操作提取总RNA，按逆转录试剂盒说明书操作合成cDNA。②TrkB 引物序列上游: 5'-TGTCAAGTTCTACGGTGTCTGTG-3'；下游：5'-ATGCACTCTATCACCTCATTGTT-3'。BDNF引物序列上游：5'-CGATTAGGTGGCTTCATAGGAGAC-3'; 下游：5'-CAGAACAGAACAGAACAGAACAGG-3'。内参照磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)引物序列: 5-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3；5-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3。③PCR反应体系上、下游引物各0.5μl，DNA模板溶液1.5μl，总反应体积为40μl。 PCR扩增反应条件: 95℃，4min；94℃，55s；56℃，45s；72℃，50s；TrkB和BDNF为32个循环，GAPDH为24个循环。PCR产物在2% 琼脂糖凝胶中电泳分离，出现目的片段条带即作为阳性表达。

1.3.3不同浓度BDNF和K252a对卵母细胞释放第一极体的影响40只21日龄小鼠在注射PMSG 48h后处死，40只小鼠(分3次实验进行，分别为10,15，15只)，取出双侧卵巢组织中体积最大的2个卵泡，放入不加抗生素的L-15 培养基中培养，置37℃的N2:O2为1:1的培养箱中，在轻微晃动的平板上培养6个h，立体显微镜下用注射器刺破卵泡，用合适的巴斯德移液管把卵-卵丘复合物取出，放入M2培养基中洗2次后转移到另外一个不含胎牛血清的M16培养瓶中培养。把取得卵-卵丘复合物均等置于5个培养皿培养，并分为观察组和对照组：观察组加入不同浓度(1，3，10，30ng/ml)的BDNF，对照组加入相等体积的磷酸缓冲盐溶液(PBS),在37℃、5%CO2和95%空气培养箱中培养24h；在M16培养基中把卵丘细胞去掉，用立体显微镜观察第一极体排出的发生率。24只小鼠(分3次实验进行，分别为6,9,9只)腹腔注射7.5U PMSG，48h后均注射5U hCG，观察组腹腔注射hCG后立即分别腹腔注射10,20μg的K252a，对照组仅腹腔注射相同体积的生理盐水，12h后处死小鼠，在输卵管内取卵-卵丘复合物，每只小鼠取2～4枚。将两组分别取卵-卵丘复合物30、22和17枚，分别培养于含透明质酸酶的培养基中放置2min去除卵丘细胞。用立体显微镜观察卵母细胞第一极体排出的发生率。

1.4 统计学方法

采用SPSS 24.0统计分析。BDNF对卵母细胞的第一极体释放百分率采用单因素方差分析；BDNF受体TrkB的抑制剂K252a对卵母细胞第一极体释放百分率比较用t检验。P<0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 小鼠卵巢组织BDNF和TrkB的表达

用基因芯片分析在PMSG和hCG续贯作用下卵巢组织中BDNF和TrkB表达的变化，以及用RT-PCR分析BDNF及TrkB在不同卵泡组织中的表达。加入PMSG和hCG后BDNF的表达量均有升高，有2个峰值，且随时间延长BDNF峰变化趋于平缓；TrkB同样也存在2个峰值，但峰值均较小，见图1(1778页)。用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参基因，用琼脂糖凝胶电泳进行检测，BDNF在卵丘细胞，壁层颗粒细胞和卵母细胞中均有表达，TrKB仅在卵母细胞上表达，见图2(1778页)。

2.2 不同浓度BDNF对卵母细胞释放第一极体影响

对照组和观察组卵母细胞释放第一极体的百分率有统计学差异(P<0.05)。0，1，3，10，30ng/ml浓度的BDNF促进第一极体排出率分别为(31.89±7.48)%、(52.78±8.09)%、(67.34±8.12)%、(64.80±7.24)%、(58.34±8.34)%。即浓度为3ng/ml的BDNF促进第一极体的排出率高于其他浓度组。

2.3 不同剂量的TrkB抑制剂K252a对小鼠卵母细胞释放第一极体的影响

不同剂量的BDNF受体TrkB抑制剂K252a均可使卵母细胞第一极体释放率降低(P<0.05)。0，10和20μg的K252a促进卵母细胞第一极体释放率分别为(77.57±6.03)%、(51.61±7.15)%、(50.73±0.9)%，不同剂量组间无差异。

3 讨论

3.1 BDNF及其受体TrkB在卵巢组织和卵泡中表达

在哺乳动物生殖过程中，不但垂体分泌的FSH和LH与卵母细胞及其周围的卵丘细胞和壁层颗粒细胞发生作用，在卵细胞的成熟和排卵过程中发挥重要作用，同时卵母细胞及其周围细胞的旁分泌和自分泌在卵母细胞的成熟和排卵中也同样发挥着必不可少的作用[5-7]。近年研究发现多种神经生长因子及其受体等在卵巢组织中表达[8-9]，BDNF是神经营养因子家族的一个重要成员，除在神经元发育和神经纤维的生长分化和存活中发挥重要作用，其在肿瘤发生等多种生理和病理活动中同样发挥重要作用[10-13]。TrkB是BDNF 的高亲和力受体，参与肿瘤细胞的多种生物学活动，并与肿瘤预后密切相关[14-15]。最近发现BDNF和TrkB在卵巢组织中表达，是新近发现的调节卵巢功能的一个新靶点[1-2]。

本研究通过基因芯片分析发现BDNF和TrkB均在卵巢组织中表达，经RT-PCR进一步细分析发现BDNF在卵丘细胞，壁层颗粒细胞和卵母细胞组织中也有表达，而TrkB主要在卵母细胞上表达。说明卵丘细胞、壁层颗粒细胞和卵母细胞上分泌的BDNF均可能通过自分泌和旁分泌直接作用于卵母细胞上BDNF的受体TrkB，促进卵母细胞发育、成熟和排卵。在模拟卵母细胞成熟过程中先后用PMSG和hCG序贯刺激，BDNF先后出现2个峰值，尤其后面的峰值更大，说明FSH和hCG对BDNF产生均有影响，但hCG产生的影响更大，可能与排卵的需要有关，这与临床上应用hCG促进卵泡的排卵相符；而TrkB在模拟卵母细胞成熟的过程中同样出现2个与BDNF相对应的峰值，但这俩个峰值均低于BDNF峰值。BDNF和TrkB两者峰值出现后均渐趋于一个平稳的值。促性腺激素释放激素是调控卵泡发育和成熟的重要激素，推测其可能增加BDNF的分泌及其受体TrkB在卵泡组织中的表达。Buyuk等[16]认为BDNF与其高亲和受体TrkB相结合，通过G蛋白促进磷脂酶C和肌醇三磷酸依赖的Ca2+离子释放,实现其调控卵泡发育的生物学效应。该研究初步说明BDNF和TrkB可能在卵母细胞的成熟过程中和第一极体的释放过程中发挥重要作用。

3.2 BDNF和TrkB的阻断剂K252a对卵母细胞第一极体释放的影响

研究发现BDNF中的4个主要营养因子(NGF、BDNF、NT-3和NT-45)及它们的受体(TrkA、 TrkB、 Trk C和p75 NFR )均在卵巢的早期卵泡中表达，其可能通过自分泌和旁分泌调节卵泡的发育、成熟和排卵[17-20]。但BDNF在卵母细胞第一极体释放中的作用尚无探讨。本研究利用不同浓度BDNF刺激去除卵丘的卵母细胞，发现不同的浓度BDNF均能增加去除卵丘的卵母细胞释放第一极体的百分率，且同时研究发现BDNF刺激卵母细胞释放的最合适浓度为3ng/ml，该浓度可能与卵母细胞的TrkB受体数量有关。为了进一步探讨BDNF在卵泡成熟和第一极体排出中的作用，利用不同剂量的BDNF受体TrkB的阻断剂K252a进行老鼠腹腔注射，观察对卵母细胞释放第一极体的影响，本研究发现不同剂量的K252a均能抑制卵母细胞第一极体释放的百分率。Moraes 等[14,20]研究认为，BDNF与其高亲和力受体TrkB相结合，通过上调细胞内超氧化物歧化酶、谷胱甘肽酶和谷胱甘肽过氧化物酶等,激活RAS/MAPK信号通路途径,从而调节相关基因的转录,促进细胞存活和分化和成熟；体内实验再次说明BDNF在卵母细胞第一极体释放中发挥重要作用。

本研究初步证实BDNF能促进卵母细胞的成熟和第一极体的释放，但BDNF及其受体TrkB是通过何种途径促进卵母细胞的成熟和第一极体的释放，以及其在早期胚胎发育中的作用需要进一步探讨，将为临床探讨生殖机理和解决生殖问题提供理论帮助和指导。