我国部分地区羊驼十二指肠贾第虫的PCR 检测和鉴定

黄玫瑰，张齐元，汪 文，2，徐春艳，侯旻昱，王 甜，井 波*

（1.塔里木大学动物科学学院，新疆生产建设兵团塔里木动物疫病诊断与防控工程实验室新疆阿拉尔 843300；2.阿克苏职业技术学院，新疆阿克苏 843000）

十二指肠贾第虫（Giardia duodenalis）是人和动物常见的人兽共患肠道寄生原虫，宿主范围广泛[1]。家畜、宠物和野生动物等动物粪便中的十二指肠贾第虫包囊常污染水源和食物，导致人畜贾第虫病的暴发和流行[2]。基于遗传进化研究，十二指肠贾第虫至少分化为8个（A-H）集聚体，集聚体A 和B 是人兽共患集聚体，主要感染人和多种动物，而其他集聚体则多存在宿主特异性[1,3]。我国自2002 年首次从澳大利亚引种羊驼，随后建立多个基地进行繁育和推广，用于毛纺业、观光业和旅游业的发展，甚至部分作为宠物，与人接触密切[4]。1987 年，在美国威斯康星州首次报道大羊驼感染十二指肠贾第虫，随后陆续在美国、秘鲁和澳大利亚等国家均有美洲驼感染十二指肠贾第虫的报道[5-8]，而我国有关羊驼感染十二指肠贾第虫的研究资料较少。本试验采用PCR 法检测我国不同地区羊驼的感染情况和鉴定基因型，以期为羊驼贾第虫病防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品来源

分别于2016 年8 月至2017 年7 月和2019 年7 至8 月收集塔城市、温宿县、和静县、青河县、尼勒克县、青岛市、繁峙县、代县和阳曲县养殖基地的羊驼粪便（20～30 g）样本484份，带回实验室置于4 ℃冷藏箱保存。羊驼多数为成年母驼，采集样本时均未见腹泻。

1.2 DNA提取

每份粪便样本在自封袋内充分揉匀后，分别用一次性筷子挑取约300 mg，置于洁净的2 mL 离心管内，使用粪便全基因组DNA 提取试剂盒（E.Z.N.A.®D4015-02，美国OMEGA Bio-Tek 公司生产），按照说明书步骤操作提取200 μL DNA，置-20 ℃保存。

1.3 PCR扩增

参考Appelbee 等[9]的十二指肠贾第虫小亚基核糖体RNA（SSU rRNA）基因引物序列。引物由苏州金维智生物科技有限公司合成。其中，第一轮上游序列为5'-AAGTGTGGTGCAGACGGACTC-3'，下游序列为5'-CTGCTGCCGTCCTTGGATGT-3'，目的片段为497 bp；第二轮上游序列为5'-CATCCGGTCGATCCTGCC-3'，下游序列为5'-AGTCGAACCCTGATTCTCCGCCAGG-3'，目的片段为299 bp。PCR反应体系25 μL：模板DNA 1 μL、10×Buffer 2.5 μL、dNTPs 2 μL、rTaq酶0.15 μL、上下游引物（20 μmol/L）各0.3 μL、二甲基亚砜（DMSO）1.25 μL、双蒸水17.5 μL。第一轮和第二轮的退火温度分别为55 ℃和59 ℃。PCR反应结束后，取5 μLPCR产物于1.5%的琼脂糖凝胶中进行电泳，凝胶成像系统中检查结果。

1.4 测序与序列分析

PCR 扩增出目的片段的产物，委托苏州金维智生物科技有限公司进行双向测序。将测定序列进行拼接，在NCBI数据库中进行BLAST 搜索，应用Clustal X 2.11软件对所获序列进行比对分析，鉴定十二指肠贾第虫集聚体。

2 结果与分析

2.1 羊驼十二指肠贾第虫感染情况（见图1、表1）

图1 十二指肠贾第虫SSU rRNA基因的PCR扩增Fig.1 PCR amplication based on SSU rRNA gene of G.duodenalis

由图1、表1 可知，对484 份羊驼粪便样本DNA 进行PCR 扩增，有8 份扩增出目的片段条带，十二指肠贾第虫总感染率为1.7%。9个养殖基地中，温宿县、和静县、青河县、尼勒克县、代县和阳曲县羊驼十二指肠贾第虫感染率分别为3.0%、5.0%、2.9%、8.3%、2.6%和0.5%；而塔城市、青岛市和繁峙县的羊驼均未发现十二指肠贾第虫感染。

表1 我国不同地区羊驼十二指肠贾第虫感染情况Tab.1 Infection of G.duodenalis in alpaca in different collection sites in China

2.2 十二指肠贾第虫集聚体鉴定

扩增出的8 个十二指肠贾第虫阳性样本均成功双向测序，序列比对分析结果表明，5 条序列与我国马源十二指肠贾第虫集聚体A（序列登录号：MN174121）同源性为100%，鉴定为集聚体A；3 条序列与我国猴源十二指肠贾第虫集聚体B（KJ888984）同源性为100%，鉴定为集聚体B；8 个样本均为人兽共患集聚体。

3 讨论

2008 年，Trout 等[6]对美国马里兰州的羊驼十二指肠贾第虫感染情况进行调查，发现感染率为4.9%。Gomez-Puerta等[5]和Gómez-Couso等[7]分别于2012年和2014年对秘鲁羊驼的十二指肠贾第虫感染情况进行调查，发现感染率较高，分别为13.0%和50.0%。2018 年，Koehler 等[8]报道澳大利亚不同羊驼群的十二指肠贾第虫的感染率为7.4%。本次调查发现，我国羊驼十二指肠贾第虫感染率为1.7%，低于秘鲁、美国马里兰州和澳大利亚等地羊驼十二指肠贾第虫的感染率，可能与调查中的样本多来自成年羊驼有关。在秘鲁的一项调查显示，小于1月龄羊驼和成年羊驼的感染率分别为33.3%和1.8%，存在显著的年龄差异[5]。目前，我国多数羊驼养殖基地多是引种、扩繁和销售模式，幼龄羊驼在基地中相对较少。在今后的调查中，应加强对幼龄羊驼的调查。

十二指肠贾第虫的8种集聚体（A-H）中，集聚体A和集聚体B为人兽共患集聚体，具有广泛的宿主，可通过污染水源感染人和动物[1-2]。在马里兰州的调查显示，3份羊驼阳性十二指肠贾第虫样本均为集聚体A[5]；在秘鲁的调查显示，46 份羊驼羊驼阳性十二指肠贾第虫样本37 份为集聚体A，9份为集聚体E[6]。在秘鲁的另一项调查显示，基于2个基因位点，对137个羊驼十二指肠贾第虫显微镜镜检阳性样本进行PCR 扩增，成功获得92 条序列，其中，67 条为集聚体A，24 条为集聚体E，1 条为集聚体A 和E 混合感染[7]。在澳大利亚的调查显示，6 份羊驼羊驼阳性十二指肠贾第虫样本5份为集聚体A，1份为集聚体E。本次调查发现，我国不同地区羊驼感染的十二指肠贾第虫以集聚体A 为优势集聚体，与上述报道的调查结果相一致；同时发现羊驼可感染集聚体B，是否还感染其他集聚体有待于进一步调查研究。

4 结论

调查结果显示，我国部分地区羊驼十二指肠贾第虫感染率较低，存在人兽共患集聚体A 和集聚体B，提示具有潜在的人兽共患风险。