光-电信号装置及其在神经血管耦合中的研究进展

张雅檬，宁 雪，姚柳叶，钱志余，李韪韬*

（1.南京航空航天大学生物医学工程系，南京 210016；2.南京工程学院计算机工程学院，南京 211167）

0 引言

大脑是人体最重要也是最复杂的器官，作为躯体其他器官的控制中枢，脑功能的正常发挥依赖于神经活动和血流动力学的紧密联系。脑组织通过血液循环来获得氧气和葡萄糖等。由于大脑各功能区激活时对脑区能量供给有差异性要求，因此脑血液供应需要达到较高要求，否则将造成严重后果[1]。一方面，大脑血液供应完全中断超过几分钟，如当中风阻塞脑动脉或心脏骤停出现泵衰竭时，会导致无法挽回的脑损伤甚至脑死亡；另一方面，血流减少到与脑组织能量需求不匹配后，就会导致大脑细微变化，从而导致与认知障碍相关的易发区慢性脑损伤[2]。因此，人们长期致力于研究大脑神经活动与血流动力学的关系，即神经血管耦合。

随着科技的进步，多学科交叉融合为脑科学的发展提供了新的手段。其中，光-电信号装置作为神经科学研究的重要手段，具有较好的时间-空间分辨力，并可从微观的神经元研究跨到宏观的血流动力学研究，多尺度、多模态地研究大脑神经血管耦合。因此，本文重点介绍光-电信号装置及其在神经血管耦合中的研究进展，探讨光-电信号装置应用于神经血管耦合研究的优势和局限性，以期为脑疾病诊断和疗效评估提供一个新的方向。

1 神经血管耦合的研究进展

神经血管耦合指的是大脑的神经电位活动与血管之间的动态信息交流机制，其结构包含神经元细胞、星形胶质细胞、血管平滑肌细胞和内皮细胞等组织，强调血流与神经细胞两者之间的紧密联系[3]。神经血管耦合的研究始于19 世纪晚期，如图1 所示[4]。早在1890 年，Roy 等[4]观察到脑窒息或脑低氧期间释放出的代谢产物会扩张脑血管。1950 年，Fregang等[5]通过一系列实验发现脑代谢底物和脑血流量之间存在耦合效应，并提出了神经血管耦合的假说。自此，大量神经血管耦合的研究逐渐展开。2001 年，神经血管耦合在国际神经科学大会上由脑卒中评估小组正式提出并确立后，呈现井喷式发展，基于神经血管耦合主题的文献数量由2001 年的不足100 篇发展到2017 年的6 500 多篇[6]。自此，神经血管耦合吸引了神经科学家的目光，而后在技术、方法和理论上都取得了长足的进步，并广泛应用于大脑认知功能的各方面以及多种神经功能疾病的研究。

图1 神经血管耦合概念的研究发展史[4]

在神经退行性疾病研究中，Thomas 等[7]发现Aβ蛋白造成神经元的表达障碍，且损伤内皮细胞造成血管收缩，加剧阿尔茨海默症的症状。随后Niwa 等[8]发现不同组别小鼠脑血管的功能性充血程度与大脑中的Aβ 蛋白含量相关，即Aβ 蛋白调节神经血管单元中的内皮功能并改变脑血流量。Martin 等[9]发现额颞叶痴呆的主要特征是星形胶质细胞的增生和损伤，且星形胶质细胞的退化与脑血流量呈负相关，说明胶质细胞的损伤与血流速度直接相关。Guan 等[10]在研究帕金森病晚期时，发现内皮细胞核的损伤会导致毛细微血管的通透性变大。在脑功能研究中，刘睿旭等[11]通过对侧运动区的重复经颅磁刺激，发现脑功能区兴奋性与神经血管耦合相关，通过改变刺激电极的电流频率，激活了大鼠脑功能区并发现相应脑区血氧消耗明显增加。

综上所述，血脑屏障的损伤可造成神经血管耦合特性改变，引起脑血管疾病、神经退行性疾病和认知障碍等发生，威胁人类健康。通过光-电信号装置研究神经血管耦合对于疾病监测和神经科学发展具有重要意义，因此，本文重点对此进行综述。

2 光-电信号装置及其在神经血管耦合中的研究进展

2.1 电生理信号采集系统

电生理信号采集系统一般由神经信号放大器、信号处理器、稳压电源和微电极等组成。当微电极被植入动物脑区后，动物脑功能区的神经元电位信号可通过信号放大器放大，再经由模数转换器转换为数字信号，通过滤波去噪等信号处理获取神经元场电位信号和神经元锋电位信号。目前，比较成熟的电生理信号采集系统有Blackrock 公司的Cerebus 多通道神经信号采集系统和Plexon 公司的OmniPlex在体多通道神经信号采集系统[12]。

在电生理信号采集中，微电极作为记录神经信号的最初传感端，是电生理信号采集系统的关键装置。经过几十年的发展，已经出现多种不同类型的微电极。金属丝微电极从20 世纪中期开始就被应用于记录神经元电信号，是最常见的微电极之一[13]。金属丝微电极阵列具有体积小、记录点多、植入方便等优点，可广泛应用于在体大鼠等哺乳类动物神经元场电位信号和锋电位信号的记录。

常用微电极阵列分为水平型和垂直型2 种，水平型记录点位于记录杆的尖端，适合用于大脑皮层浅表组织的神经信号检测；垂直型记录点依次排列在记录杆上，适合于深部脑组织的记录，其中Utah电极和Michigan 电极最典型[14-15]。Utah 电极（如图2所示）在4 mm×4 mm 的硅基板上集成了100 根针形微电极，每根电极轴长度为1.5 mm，尖端由铂金包裹，阻抗范围为100～800 kΩ，电极轴的间距为400 μm，该电极主要应用于神经修复和脑机接口[16]。

Przedborski[17]通过微电极装置植入脑干，发现特发性帕金森病中运动功能障碍和认知障碍都始于脑干的黑纹状体传导路径，且进一步研究发现胶质细胞活动导致与其接触的内皮细胞功能异常。Voytek等[18]通过电生理信号采集系统发现大鼠AD 模型中脑干-前脑基底节、丘脑-皮层、皮质半球内-半球间3 个通路神经的锋电位发放都存在去耦合现象。此外，通过脑功能成像装置的联合研究，研究人员发现神经信号通过神经血管耦合直接或间接作用于局部血管来调节脑血流量，以维持脑微循环平衡，如黄明亮[19]采用微电极阵列和内源光信号装置研究了体感运动区的神经血管耦合，利用格兰杰因果分析提出了神经调控关系。

图2 Utah 电极[16]

总之，电生理信号采集系统的发展使大脑神经的系统研究逐渐深入到细胞层次，该系统是揭示神经血管耦合机理、治疗神经疾病和促进神经康复的重要工具。

2.2 光子显微荧光成像系统

光子显微荧光成像的原理是神经元通过荧光指示剂和膜蛋白的结合，能够直接测量显示神经元上膜电压的变化，但并不是所有的指示剂都具有良好的信噪比，目前应用最为广泛的测量神经元活动的指示剂是钙离子指示剂。1990 年，Denk 团队开发了世界上第一台双光子激光扫描显微镜，其可对神经元活动成像，此后光子荧光成像就以其侵入性低、穿透性高、空间分辨力高等优势走进人们的视野[20]。

近年来，随着荧光标记物和显微成像技术的不断发展，光子显微荧光成像系统也在高速发展。根据其采用的主要技术原理，大体分为如下几类：光片显微荧光成像系统、单光子显微荧光成像系统、多光子显微荧光成像系统以及在这些基础上加以改进的成像系统。其中以双光子显微荧光成像系统应用于神经科学领域最为广泛和普遍。当前，商用比较出名的是Inscopix 公司的nVoke 单光子显微荧光成像系统，该系统可同时结合光遗传学中的神经光调控和大视野钙离子成像[21]。

2011 年，Truong 等[22]首次提出双光子光片显微镜的概念并在实验中验证了其在空间分辨力、成像深度和成像速度方面的优势。2014 年，Zong 等[23]发明了高分辨力下最大成像视场的三轴扫描双光子光片显微镜系统，如图3 所示。Kim 等[24]使用双光子显微荧光成像系统进行大视场成像，通过人造的水晶颅骨片同时观测到最多30～40 个神经元脑区，达到了亚细胞级别的分辨力，揭示了自由活动小鼠清醒状态下的神经钙离子动态活动。Li 等[25]通过双光子显微荧光钙离子成像，结合在体光纤系统，在简单听觉联想测试实验中首次验证了听觉皮层Au1 区的小鼠预期行为反应，并将其应用于神经血管耦合的研究。

当前，光子显微荧光成像系统已被越来越多地应用到神经科学领域中，以其高空间分辨力和固有的光学层析能力的优点可实现亚细胞级别的多种荧光团的实时动态监测，可对生物组织功能精确定量表征，是神经血管耦合研究取得突破的重要研究系统之一。

图3 三轴扫描双光子光片显微镜系统光路示意图[23]

2.3 激光散斑成像系统

激光散斑是一种光学干涉相关现象，散斑图案形成是因为受激光照射的物体表面会随机产生散射的颗粒状图样，并且物体表面的颗粒移动会导致散射光的相位平移，进而改变随机干涉模式，从而造成散射颗粒形成特有的动态散斑。自20 世纪90 年代以来，研究人员通过改进激光散斑成像系统，将其应用于生物流速检测的成像领域[26]。

1981 年，Fercher 等[27]基于散射特性首先将洛伦兹谱型的速度分布应用于激光散斑衬比成像技术。目前，比较成熟的激光散斑成像系统是英国MoorLab公司的血流成像系统和瑞典Perimed 公司的激光多普勒成像系统[28-29]。激光散斑成像系统一直在改进之中。Qiu 等[30]通过改进相机的曝光时间、暗噪声以及采用线阵扫描算法，提高散斑成像的分辨力和运算速度，改进了成像系统，并将其运用在大鼠扩散性皮层抑制（cortical spreading depression，CSD）的研究中，发现CSD 过程中胞内pH 会经历一个快速酸化及小幅碱化的变化过程，并伴随有软脑膜动脉血管的舒张、皮层的充血、脑脊液（cerebrospinal fluid，CSF）和含氧血红蛋白（HbO2）、脱氧血红蛋白（HbR）浓度的改变。Miao 等[31]采用嵌入式处理器和电荷耦合元件（charge-coupled device，CCD）设计了一种微型化激光散斑成像系统，该系统可以固定在研究动物的身上，可用于观测清醒状态下大鼠的血流速度。Yuan 等[32]通过激光散斑成像系统发现脑中风导致的CSD 会引起脑血流量变化。Sivakumar 等[33]采用高帧频相机改进了多曝光激光散斑成像系统，该高帧频相机的传感器以全局快门的模式运行，以超过30 f/s 的帧率采集图像，其血流成像图像可达到视频合成的时间分辨力。

2.4 内源光信号成像系统

光学内源信号是指在不对组织施加外源染料情况下，组织本身的自发光学特性改变而被采集到的信号。脑组织的吸收特性和多种生色团有关，包括HbO2、HbR、细胞内细胞色素氧化酶、神经递质等。脑区神经活动会引起局部HbO2和HbR 浓度的变化，从而改变脑组织的吸收特性，因此光学内源信号是对神经元电活动的间接表达。

多光谱内源光信号成像系统主要包括宽带光源、滤光片、立体显微镜头和CCD 相机。在成像采集中，可通过改变滤光片来改变实验中的照射光波长。目前，尹翠[34]采用液晶可调谐滤波器（liquid crystal tunable filter，LCTF）将采样时间缩短到50 ms 以内，且可在400～720 nm 波长范围内以1 nm 步长随意转换，实现自动控制滤光片，并设计了实时内源光信号的高速采集系统，首次同时监测到小鼠在体CSD 过程中HbO2、HbR、黄素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenosine dinucleotide，FAD）、细胞色素氧化酶的变化。Schwartz 等[35]通过设计2 条独立的扫描臂，采用分时复用共享光纤和光学器件，可相对同步地采集血液动力学中的氧分压[p（O）2]、脑血流量、HbO2、HbR 以及还原型辅酶（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）和钙离子波动，如图4 所示。

图4 多模态光学设备图[35]

内源光信号成像系统的研究主要集中在神经功能活动方面，特别是针对神经血管耦合的研究。1949年，Hill 等[36]首先在离体的海蟹神经纤维上观察到神经活动，并发现其会造成光散射的增强。随后，Cohen等[37]在分离的神经纤维上发现光散射增强与鱿鱼轴突的动作电位相关。Lu 等[38]通过提高内源光信号成像系统的时间分辨力，成功采集到实验猴视觉刺激后的神经活动反应和血流的瞬时关联反应，说明高时空分辨力的内源光信号装置可应用于清醒状态下动物行为实验瞬时反应研究。同时，内源光信号成像系统也应用于临床相关的病例学研究。Schwartz 等[39]应用神经递质阻断剂诱导雪貂皮层癫痫的模型，在体研究内源光信号成像结果，与光学成像同时进行的电生理记录证实了所记录到的光反射信号变化在空间上与产生放电神经元的总量相关，且实验结果与采用功能性磁共振成像（functional magnetic resonance imaging，fMRI）等技术在人体癫痫病灶变化中的研究结果有很好的一致性。胡学斌[40]利用多光谱内源光信号系统研究了大鼠CSD 的产生、发展和传播过程，并结合电生理信号采集系统验证了CSD 对大鼠脑缺血性损伤的保护作用。

2.5 光声成像系统

光声成像是一种较新的成像方法，其基于光声效应原理，无创地获取物体二维断层或三维立体的成像。光声效应是指物体受到短脉冲高强度激光照射后，物体内部将会产生周期性变化的现象，并可被超声探头探测。目前，已上市的光声成像系统有美国TomoWave 公司的小动物成像系统[41]和德国iThera Medical 公司的医用光声成像系统[42]。

光声成像由于无创、无辐射且具有较高分辨力的特点，是近年来人们研究的热点。Zhang 等[43]将高分辨力（150 μm 空间分辨力）光声成像系统首次应用于癫痫病发作的成像中，发现与传统神经成像方式相比，其具有超高的空间分辨力。Li 等[44]采用高强度近红外染料标记间充质干细胞，通过采用光声成像系统研究了脑屏障通透性和小鼠脑损伤恢复性，发现脑损伤恢复与神经血管耦合相关，如图5 所示。杨思华等[45]通过搭建一套旋转扫描光声成像采集系统对脑损伤动物进行在体成像检测研究，并进一步定量脑损伤程度与血脑屏障的关联性。Bi 等[46]通过光声成像系统观察了康普瑞啶磷酸二钠作用于脑内接种原位胶质瘤的小鼠，通过对神经元、胶质细胞和血管壁的神经血管耦合单元监测，从而验证出该药物对于神经微血管的血管关闭和恢复调控作用。

图5 颅脑损伤后小鼠的自然恢复过程检测[44]

血液中的血红蛋白是可见光和近红外范围波段的主要吸收物质，采用该波段激光的光声成像技术可应用于脑血管结构和功能研究中。Hu 等[47]采用三脉冲激发光建立快速光声显微镜系统，可同时采集到血红蛋白浓度、血流速度和血氧饱和度。Liu 等[48]基于拉曼散射单波长改进光声成像系统，可同时对血管结构和HbO2浓度成像，并可实现脑微血管动静脉分割。

2.6 光-电信号联合系统

为了深入探究神经血管耦合，多模态光-电信号联合系统被应用于动物模型。Liu 等[49]将16 通道微电极与功能光声成像集成为μECoG-fPAM 系统，同步测定神经元发放和血流动力学参数，用来研究脑缺血模型的神经血管耦合。Baker 等[50]利用激光散斑成像系统和内源光信号成像系统研究前肢刺激大鼠模型的脑血流量、血氧值、代谢产物，并通过瞬时诱发电位分析各参数的耦合关系。Wang 等[51]将光声传感器技术和脑电图技术集成到一个小型便携式设备，可以连接在自由活动的唤醒动物头上，这是首次自由活动动物癫痫发作的血流动力学监测研究。Liao等[52]采用脑皮层信号与功能光声显微成像技术研究大鼠的局灶性脑缺血的神经血管耦合特性，发现血红蛋白总量、脑血容量和血氧饱和度的改变与小动脉诱导的卒中相关，并证明了该联合技术研究小动物脑缺血模型的优越性。

综上所述，光-电信号联合系统测量神经元活动和血流动力学参数能够在时空上反映出对于多种物理刺激或者药物作用下神经血管耦合各参数的瞬时响应，动态观测到大脑的神经活动、能量交换甚至病理变化，为神经科学研究中认知障碍、神经退行性疾病和脑血管疾病诊断和监测提供了技术手段。

3 结语

光-电信号装置发展至今已有50 多年的历史，已发展出多种成像方法，可实时同步地观测神经血管中神经信号、血流动力学等参数的瞬时响应，从不同的空间和时间尺度上研究脑功能活动，突破了传统的影像学方法的时间分辨力较低的局限性，对于神经血管耦合及其相关疾病机理研究有重要意义，并为脑血管疾病、神经退行性疾病和认知障碍等疾病的诊断提供了一种全面的技术支持。

相较于传统的离体免疫组化和影像学设备，光-电信号装置依然有其局限和不足。由于光颅骨穿透性和电生理信号的放大问题，在采用光-电信号装置研究神经血管耦合时，依然需要有创操作甚至开颅，这对于长期研究脑血管疾病的动物模型以及进一步临床疾病监测具有很大的限制性；此外，脑皮层组织作为一种独特的高散射混浊介质，光学系数如光源和入射角度的改变都会对系统成像的信噪比有影响，导致获得的个体信号强度存在较大差异性，并且获得的图像和信号定标存在一定困难，甚至很难定量分析神经血管耦合参数；同时对于需要荧光标记使用的光子显微荧光成像，其关键核心依然是荧光蛋白标记，因此很难应用于临床研究。

随着神经科学和工程科学的发展以及光学材料的改进和技术进步，光-电信号装置的成像深度、时间分辨力和空间分辨力都将会逐步提高，从而建立神经血管耦合的量化模型，为在体脑血管疾病、神经退行性疾病和认知障碍疾病的监测和诊断提供指导方案。由于神经血管耦合中神经细胞、内皮细胞和血管细胞相互作用，其分子间复杂协调工作尚不明确，采用光-电信号联合系统和传统方法共同研究，通过建立特定神经血管耦合参数与生化组织参数的关联量化模型，可为神经血管耦合研究提供新的思路。另外，不同模态的光-电信号技术更新也会促进光-电信号联合系统的融合和发展，从不同尺度观测大脑的神经活动、能量交换甚至病理变化，从而为神经科学研究中的认知障碍、神经退行性疾病和脑血管疾病机理研究和临床监测提供新的方向和工具。