清香型白酒酿造核心功能微生物的研究与应用

杜艾明，李 良，李俊薇，胡申才*

（1.武汉轻工大学 生物与制药工程学院，湖北 武汉 430023；2.黄鹤楼酒业有限公司，湖北 武汉 430050）

清香型白酒主要是以其无色、清亮透明、清香纯正等特点深受广大消费者的喜爱。除了大家熟知的山西汾酒、湖北黄鹤楼酒以及北京二锅头之外，河南宝丰酒、浙江同山烧、河南龙兴酒、青稞酒、厦门高粱酒和天长帝酒等也都属于清香型白酒。

清香型白酒具有“清香纯正，醇甜柔和，自然谐调，余味爽净”的风格特点。这些风格特点与清香型白酒的“清蒸清茬、地缸发酵、清蒸二次清”酿造工艺特点是紧密相关联的。清香型白酒酿造工艺讲究的就是“清字当头，净字到底”，那么该酿造工序中微生物群落组成和演化交替过程是怎么样的呢？酿造过程中产生了哪些风味物质？这些风味物质是如何代谢产生的？要回答好这些问题，就需要剖析微生物群落组成和解析风味代谢物质成分及形成机理，而随着微生物基因组学、转录组学及代谢组学相关技术的发展，这些研究热点问题都得到了一定程度的解答。本文对近年来清香型白酒酿造的微生物群落组成、核心微生物组成及相互作用和主要代谢风味物质及产生机理进行了归纳总结，以期为同行提供参考，推陈出新，酿造出质量更好、营养健康价值更高的清香型白酒。

1 清香型白酒酿造工艺

从不同曲法发酵来看，清香型白酒主要有大曲清香、小曲清香、麸曲清香。大曲酒的生产工艺通常采用“清蒸清烧、地缸发酵、清蒸两次清”。该工艺将发酵所用的粉碎高粱和辅料进行蒸煮处理，将蒸煮后的高粱拌入低温大曲和辅料，置于埋入土中的陶瓷缸中发酵28 d后蒸得第一次酒，即大米查酒。蒸馏后的酒醅不再配入新料，只加曲和辅料后即可进行第二次发酵，28 d后取出蒸得第二次酒，即二米查酒。将两次蒸馏后的酒储存一定年限经勾兑即得清香型白酒[1-2]。

2 酿造微生物群落组成及分布

酿造过程复杂，是自然发生的“多微共酵”固态发酵过程。曲粉作为发酵起始剂，在发酵过程的微生态中担负着重要作用，但环境微生态因素和地缸不同相位所创造的不同小微生态位的影响作用也不容小觑。

2.1 大曲微生物群落组成

曲为酒之魂，不同来源的大曲，其中所含微生物种类也有着差别。ZHENG X W等[3]采用传统分离培养结合聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（polymerase chain reactiondenatured gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技术从汾酒大曲中检测到109种细菌和81种真菌，其中地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）占到了细菌总数的57%，另外短杆菌（Brevibacteriumsp.）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）等乳酸菌分别占到总细菌数的4%、17%、6%和6%。在DGGE法中还发现了传统培养法未分离得到的食窦魏斯氏菌（Weissella cibaria）、融合魏斯氏菌（Weissella confuse）、腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、三叉乳酸杆菌（Lactobacillus sanfranciscensis）、乳酸乳杆菌（L.lactis）和巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）；叶光斌等[4]通过构建细菌16S rRNA基因文库、限制性片段长度多态性（restricted fragment length polymorphism，RFLP）指纹图谱分析、测序和系统发育学分析发现大曲中的细菌包括乳杆菌（Lactobacillus）、芽孢杆菌属（Bacillus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、假单胞菌（Pseudomonas）和高温放线菌（Thermoactinomyces）等细菌；兰玉倩等[5]研究发现，清香型白酒大曲中含有腹膜孢酵母属（Saccharomycopsis）、酵母属（Saccharomyces）、毕赤酵母属（Pichia）、假丝酵母属（Candida）、有孢汉逊酵母属（Hanseniaspora）、德巴利酵母属（Debaryomyces）、伊萨酵母属（Issatchenkia）等酵母菌。WANG H Y等[6]通过PCR-DGGE技术对几种大曲微生物群落比较分析后发现大曲中含有的乳酸菌极具丰富多样性，是绝对的优势细菌；扣囊腹膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera）和异常威克汉姆酵母（Wickerhamomycesanomalus）是主要的酵母菌，也含有一些季也蒙有孢汉逊酵母（Hanseniaspora guilliermondii）、汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii），东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）和阿氏丝孢酵母（Trichosporon asahii）等非酿酒类酵母。霉菌主要以米曲霉（Aspergillus oryzae）和布氏犁头霉（Absidia blakesleeana）为常见菌。

2.2 酿造环境微生物群落

不同的生态环境，甚至不同的厂区都可能有着不同的微生物群落组成。WANG X S等[7]通过高通量测序技术比较新厂区酒醅及老厂区酒醅中微生物种群演替规律，发现不同环境酒醅初始微生物种群结构不同，并进一步造成了酒醅中微生物演替规律及代谢的差异；同时还发现老厂区环境中白酒发酵功能微生物相对丰度高于新厂区。其中酿酒车间室内地面及工具富集了丰富的白酒酿造功能微生物，细菌种群主要包括乳杆菌属（Lactobacillus）、芽孢杆菌属（Bacillus）和魏斯氏菌属（Weissella），真菌种群主要包括毕赤酵母属（Pichia）、复膜孢酵母属（Saccharomycopsis）、酵母属（Saccharomyces）、威克汉姆酵母属（Wickerhamomyces）和曲霉属（Aspergillus）。

2.3 地缸中不同相位微生物群落组成

固态发酵以气相为连续相，这就使系统内的物质、热量和动量传递受阻，产生的“空间位阻效应”创造了不同的小微生态位，有效地避免了微生物之间的竞争，从而保持了白酒发酵过程中的微生物多样性[8]。王雪山等[9]利用高通量测序技术分析不同位置酒醅中微生物种群结构及演替规律，结果表明清香型白酒发酵过程中优势细菌种群包括乳杆菌属（Lactobacillus）、魏斯氏菌属（Weissella）、克罗彭斯特菌属（Kroppenstedtia）、假单胞菌属（Pseudomonas）、明串珠菌属（Leuconostoc）、芽孢杆菌属（Bacillus）和片球菌属（Pediococcus），优势酵母真菌种群包括毕赤酵母属（Pichia）、假丝酵母属（Candida）、曲霉属（Aspergillus）、复膜孢酵母属和哈萨克斯坦酵母（Kazachstania）。不同位置酒醅微生物种群结构在属水平存在明显差异。同时，上层酒醅微生物种群演替速率慢于中、下层酒醅，最终造成上层酒醅乙醇产生速率低于中、下层酒醅。雷振河[10]应用高通量测序技术以发酵第10天的地缸酒醅样品为研究对象，发现地缸酒醅面层往下20 cm处的地缸中心部位酒醅和靠近地缸缸壁酒醅中的微生物组成大体相同，但原核微生物中的醋酸杆菌科、乳杆菌科和芽孢杆菌科，以及真核微生物中的假丝酵母和毕赤酵母科等5种优势微生物丰富度明显不同，且双足囊菌科（Dipodascaceae）、复膜孢酵母科（Saccharomycopsidaceae）、小囊菌科（Microascaceae）等真菌仅存于中心酒醅中，在地缸缸壁边缘基本不存在。

3 核心功能微生物及其作用

不同的发酵食品由不同的核心微生物组成，这些核心微生物也为发酵食品的风味多样性和产品质量的稳定性提供了重要保证[11]。一般来说，清香型白酒酒醅发酵过程中的核心微生物群主要由不同种属的乳酸菌、醋酸杆菌、芽孢杆菌、酵母菌和少数霉菌等组成。

3.1 乳酸菌

乳酸菌以代谢产物命名，是利用碳水化合物（主要指葡萄糖）发酵成乳酸的一类菌群的统称，在白酒酿造过程中发挥着重要作用。除主要代谢产物乳酸外，乳酸菌也可产生其他有机酸。乳酸是一种重要的酒味调和物，既能掩盖酒精的刺激性，还能使酒体协调柔和。另外乳酸还可以通过酯化作用与乙醇缩合生成乳酸乙酯，形成主体香气成分之一。陈申习等[12]从清香型小曲酒机械化酿造车间发酵过程中的酒醅中分离鉴定得到了干酪乳杆菌（Lacto bacillus casei）、短乳杆菌（L.brevis）、希式乳杆菌（L.hilgardii）和瑞士乳杆菌（L.helveticus）4种乳酸菌。李锐等[14]从小曲清香型劲酒酒醅中分离到植物乳杆菌（L.plantarum）、副干酪乳杆菌（L.paracasei）、短乳杆菌（L.brevis）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、发酵乳杆菌（L.fermentum）、布氏乳杆菌（L.buchneri）和类布氏乳杆菌（L.parabuchneri）7种乳酸菌。其中植物乳杆菌（L.plantarum）、短乳杆菌（L.brevis）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）和副干酪乳杆菌（L.paracasei）4种为产乙酸细菌；植物乳杆菌（L.plan-tarum）和发酵乳杆菌（L.fermentum）为产乳酸细菌；植物乳杆菌（L.plantarum）、布氏乳杆菌（L.buchneri）和类布氏乳杆菌（L.parabuchneri）可产丁酸。

3.2 芽孢杆菌

芽孢杆菌是环境中存在非常广泛的一类微生物，随着对酿造中微生物的不断探索和发酵机理的研究，发现芽孢杆菌在中国主流大曲白酒发酵中确实起着非常重要的作用。杨春霞等[13]从牛栏山地缸酒醅中筛选出5株芽孢杆菌，分别为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、蜡样芽孢杆菌（B.cereus）、短小芽孢杆菌（B.pumilus）和枯草芽孢杆菌（B.subtilis）。不同的芽孢杆菌可产生不同风味贡献物质，如地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）与含氮化合物，蜡状芽孢杆菌（B.cereus）与醛酮类物质，短小芽孢杆菌（B.pumilus）与烃类和醇类物质，以及枯草芽孢杆菌（B.licheniformis）与杂环类化合物。

李锐等[14]从劲酒酒醅中分离到甲基营养型芽孢杆菌（B.methylotrophicus）、地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）和枯草芽孢杆菌（B.subtilis）等3种芽孢杆菌，它们都能分解蛋白质，其中甲基营养型芽孢杆菌（B.methylotrophicus）为好氧菌，还具有分解淀粉的作用。

3.3 酵母

王薇等[15]从清香型白酒固态酿造过程中共鉴定出10种酵母，分别为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）、异常威克汉姆酵母（Wick erhamomyces anomalus）、扣囊腹膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera）、发酵毕赤酵母（P.fermentans）、阿萨希丝孢酵母（Trichosporonasahii）、耐渗透压有孢汉逊酵母（H.osmophila）、粉状毕赤酵母（P.farinose）、膜璞毕赤酵母（P.membranifa ciens）和葡萄牙棒孢酵母（Clavispora lusitaniae）。其中酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）和异常威克汉姆酵母（W.anomalus）是白酒酿造过程中最核心的3种酵母菌。

乙酸乙酯的主要合成途径是酵母菌代谢，而乳酸乙酯的主要合成途径是乳酸菌产生的乳酸在和酵母菌产生的醇在酯化酶催化作用下合成的。研究指出，白酒发酵中，产酯能力强的酵母有汉逊酵母（Hansenula polymorpha）、毕赤酵母（Pichia pastoris）、假丝酵母（Candida）、酒香酵母（Brettanomyces）、白地霉（Geotrichum candidum）等[16-17]。

此外，研究发现扣囊腹膜孢酵母（S.fibuligera）可产生大量糖化酶，具有很强的糖化作用，在将淀粉转化为葡萄糖的过程中担负着重要的作用；WU Q等[18]还研究发现，酵母在代谢过程中可产生多种萜类活性物质。

3.4 霉菌

霉菌往往出现于发酵前期，随着氧气的消耗，霉菌含量也随之降低。综合来看，清香型白酒发酵过程中的霉菌主要有犁头霉、曲霉、根霉和毛霉等[19-20]。

清香型白酒酒醅中的霉菌主要来源于大曲，在酿造过程中，霉菌的数量不再增殖，参与发酵过程的主要是霉菌的酶，其酶活性发挥的作用是降解原料大分子[21]。产生的糖化酶、液化酶将淀粉分解为葡萄糖，供酵母代谢利用而产生乙醇，再通过酯化酶促进酿酒过程中不同酯类物质的形成。

4 功能菌在清香型白酒中的应用

4.1 酯化和糖化功能菌的应用

酯类物质在白酒中起着呈香作用，近年来有不少关于高产酯酵母在生产中应用的研究报道。杨强等[22]在将从酒曲中筛选出的Y29扩大培养后制成酵母麸曲，并应用于中试车间发酵，发现其乙酸乙酯含量比对照组分别提高了99.4%，达到2.004 g/L，正丙醇含量却下降了44.2%。曹苗文等[17]研究发现，在清香型白酒生产中在大曲中添加高酯曲，大楂酒总酯提高了2.350 g/L，乙酸乙酯含量提高了1.167 g/L，乳酸乙酯含量提高了0.670 g/L。管健等[23]在使用酯化红曲、生香酵母和酿酒酵母作强化麸曲时发现，发酵过程中升温速度会加快，对淀粉的利用率高，乙酸乙酯和乳酸乙酯含量也得到了提高。

扣囊腹膜孢酵母可分泌高活力的淀粉酶（α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、生淀粉糖化酶）、β-葡萄糖苷酶等水解酶类，既能水解α-1,4糖苷键和α-1,6糖苷键，又能水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖键[24]，将其作为发酵添加液加入酒醅发酵，可明显改善牛栏山清香型白酒的香气，并增强醇甜味[25]。进一步研究表明，扣囊复膜孢酵母在高粱培养基中可以生成牛栏山二锅头白酒中重要的6种香气成分[26]。潘天全等[27]在小曲清香型白酒拌曲发酵时添入0.5%的安琪根霉曲，研究结果表明根霉曲配合小曲使用明显协同促进了粮醅的糖化作用，酸类和酯类等挥发性风味成分种类增加，乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量提高明显，乙酸乙酯与乳酸乙酯比由1.42提高到1.92，使得原酒风味更为谐调，清香更为纯正。

4.2 调降乳酸乙酯含量的微生物技术开发

清香纯正主要是指清香型白酒的主体香味物质乙酸乙酯与乳酸乙酯搭配谐调，具有清雅、纯正、舒适、协调的复合香气。但在清香型白酒的生产过程中，乙酸乙酯与乳酸乙酯比例失调也是一个普遍存在的问题。乳酸乙酯含量过高，则会影响酒的口感，导致酒体放香不足和香气欠协调、后味涩苦等问题，从而降低白酒品质。

乳酸乙酯的产生依赖于乳酸的合成，酒醅中能形成乳酸的微生物多样复杂，难以调控。因此如何降低乳酸含量是调降乳酸乙酯的重要突破口，而“降乳菌”的筛选应用是一条可行途径，如牛栏山酒厂从清香型大曲中筛选出1株可降解乳酸的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），该菌可有效降低白酒中乳酸乙酯的含量，乙酸乙酯与乳酸乙酯比例失调的问题得到了很好的解决[28]。

4.3 功能菌在风味物质代谢合成与调控方面的应用

四甲基吡嗪是中国白酒中广泛存在的微量成分，能赋予酒体以咖啡和坚果的独特香气，还能发挥抗氧化、提高免疫力和防止肝纤维素化等多种生理作用。因此，四甲基吡嗪已公认为是白酒中有益于健康的一类风味活性功能物质。艾金钟等[29]将蛋白酶活性较高的芽孢杆菌菌株，应用于红星二锅头酒生产中后，原酒中四甲基吡嗪含量可达到0.010 g/L。

萜类化合物是自然界广泛存在的一大类异戊二烯衍生物（isoprenoids），有着重要的生物学功能和应用价值，生物医学研究表明萜类具有抗癌、消炎、降糖、预防心脑血管疾病、延缓衰老等药理功效。其实，清香型白酒中存在的芳樟醇（linalool）、α-松脂醇（α-terpineol）、橙花叔醇（nerolidol）、香叶醇（geraniol）、大马烯酮（β-damascenone）和金合欢醇（farnesol）也是一类重要的风味物质[30]，WU Q等[18]研究发现，酿酒酵母、东方伊萨酵母和异常汉逊酵母不但能生物转化利用高粱等谷物中含有的萜类前体物，还能从头合成芳樟醇等萜类物质，赋予清香白酒独特的风味。

5 结语

微生物无疑是支撑酒体质量的基础与核心，研究微生物群落组成、来源与其消长规律以及风味物质的代谢调控机制，以及主要功能菌间的互作关系，对于提升白酒产品竞争力至关重要。目前国内外白酒微生物研究者借助先进的高通量测序技术，可对传统白酒酿造过程及大曲、环境中微生物的可培养微生物和未培养微生物同时进行分析解读，还可借助气质联用等分析仪器对风味物质进行可视化的痕量分析，这为白酒微生物的研究提供了技术支撑，也为揭示酿酒过程中所发生的各种内在反应本质奠定了基础。

白酒酿造环境与工艺都较为特殊，系统相对开放，但又存在自身的微生态系统，多种微生物共同发酵，制曲过程和酿造过程中均发生着复杂的生理生化反应。迄今为止，行业内对复杂微生态系统内存在的微生物种类多样性和代谢多样性以及微生物各类群之间的相互作用关系还缺乏清晰的认识。核心功能微生物资源的挖掘以及代谢机制的解析，对于解决不同原料和季节差异而导致的酒体非均一性以及低出酒率必将发挥出重要作用。