浅谈参考区间的建立和验证

陈慧毅 董劲春 国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心 （北京 100081）

内容提要： 随着体外诊断（In Vitro Diagnostic，IVD）检测技术的快速发展，检测分析物种类越来越多，能够给临床提供更多的辅助诊断信息，体外诊断试剂已经成为医疗机构非常重要的一部分。定量类体外诊断试剂需要满足溯源标准化，分析性能可靠，参考区间合理等条件，才能达到临床要求。文章简要介绍参考区间建立与验证的原则、方法以及已上市产品存在的问题，为以后同类产品注册提供帮助。

参考区间是介于参考上限和参考下限之间的值，是临床做出医疗决策的重要考量因素。随着体外诊断检测技术的不断发展，各种检测项目层出不穷，虽然给临床疾病的诊断带来一定的帮助，但如果参考区间建立的不合理也会给临床决策造成误判。本文简要介绍参考区间建立和验证的一般原则、方法和上市产品临床应用中存在的一些问题。

1.参考区间的建立与验证的一般原则

第一，拟上市产品应该按照适用人群建立合理的参考区间。

第二，实验室应该优先选择卫生行政部门发布的行业标准或专家共识等证据级别较高的文件推荐使用的参考区间，并验证其在本实验室的适用性[1]。比如：WS/T404 规定了中国成年人血清丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶等指标的参考区间及其应用，可以根据实际情况参照使用。

第三，参考区间的数据转移。建立参考区间需要投入大量的人力、物力资源，如果通过一些经济、简单的验证程序进行参考区间的转移，可以使复杂的过程变成现实。

第四，实验室选择产品时，首先关注拟使用产品的参考区间人群是否合适，其次验证参考区间的适用性。

2.参考区间建立，数据转移后的验证方法[2]

2.1 参考区间建立的方法

建立一个新的分析物参考区间，需要按照以下程序进行：①查阅文献，了解影响该分析物的生物变异和干扰因素等；②建立参考个体的选择、排除和分组标准；③编制知情同意书、调查表等；④设定合适的置信区间，确定合适的参考个体人数；⑤做好采样前准备，正确收集和处理样本，在良好的质量控制条件下，对样本进行检测，获得参考值结果；⑥检查、分析数据，选择合适的统计方法，估计参考区间；⑦记录所有过程，并留存归档。

2.2 数据转移后的验证方法

拟上市产品或接收实验室希望验证已上市产品或其他供体实验室报告的参考区间进行数据转移。主要方式有以下三种。

2.2.1 主观评价验证。转移的可接受性可以主观地通过评价已上市产品/供体实验室参考区间研究的相关内容。主要评价内容包括：适用人群地理位置或人口统计学变量，分析前和分析过程的细节，产品分析性能，所有的参考值数据以及估计参考区间的方法。

2.2.2 小样本量验证。转移的可接受性还可以通过检测接收实验室自己的受试者群体中少量参考个体（n=20）来评估，并将这些检测结果与更充分的原始研究进行比较。原始参考区间研究中的分析前和分析中因素需要与接收实验室的操作保持一致。这20个参考个体应合理地代表接收实验室的健康人群，并满足排除和划分标准。测试结果应排除异常值。如果20名受试者中不超过2个（或10%的检测结果）超出最初报告的95%参考限值，则已上市产品或供体实验室报告的95%参考限值可被认为适用拟上市产品或接收实验室。如果有3或4个测试结果超出了这些限度，则应获得与前20个类似的另外20个参考样本，同样没有异常值。如果这些新结果中不超过2个超出已上市产品或供体实验室报告的参考限度，后者被认为是可接受的。但是，如果有3个或更多的结果再次超出限度，则应重新检查所使用的分析方法，考虑取样的两个人群的生物学特性可能存在差异，并考虑拟上市产品或接收实验室是否应建立自己的参考区间。

2.2.3 大样本量验证。部分参考区间对于临床分析至关重要的分析物，实验室可以选择进行更广泛的参考区间转移研究。在这种情况下，数据转移的可接受性可以通过检测接收实验室自己的受试者群体中的更大的参考个体（如n=60），并将这些参考值与更充分的原始研究进行比较来评估和验证。

3.讨论

参考区间是判断检测结果是否正常，以辅助疾病诊断的重要依据。建立参考区间入组人群与使用该产品人群的差异必然会导致结果难以解释。尤其进口产品建立适合原产国地区的参考区间，但是没有中国人群的数据，检测结果是否能够反映中国人群的真实健康状况值得商榷。建议拟上市产品注册人应该针对中国人群进行多中心研究，建立符合中国人群的参考区间。

参考区间建立研究工作量和成本巨大，随着越来越多的检验项目和方法引入实验室，独立的实验室建立参考区间不太现实，可操作性较小。实验室寻找合适的参考区间进行验证更为合理。比如：实验室采用卫生行政部门发布的行业标准或专家共识等。这样既能给出权威的判读结果，同时也有利于检验结果的互认。同时建议拟上市产品注册人在开发同类产品时，重点关注结果的可追溯性和量值溯源标准化，这样参考区间才能与临床普遍认可和使用的参考区间一致。

参考区间的数据转移是通过一些简单可行的程序，把已上市产品/供体实验室已建立的参考区间转移到拟上市产品/接收实验室非常有效的方法。但是数据转移的前提条件是检测系统的可比性和检测人群的可比性。检测系统可比性的问题，可以按照CLSI EP文件利用患者样本进行方法学比较进行评价[3]。一般情况下，如果分析系统存在类似不精确度和干扰问题，溯源到相同或类似的标准物质，采用相同的单位进行报告，并且根据方法学比较判断结果是可接受的，则可将参考区间转移到新的或替代检测系统中。另一个转移需要考量的重要因素是人群的可比性，如果原始参考区间研究的入组人群在地理分布或者人口统计学上存在差异，参考区间是不能转移的。

建议上市产品在说明书中提供参考区间研究的详细内容，包括入组人群种类、组成、参考个体数量、参考个体排除标准、分组考虑因素、数据处理和分析等内容。这些细节信息不仅可以方便其他拟上市产品用于参考区间的数据转移，还有助于实验室判断是否适用本地区。说明书中也需要提供明确的溯源信息，可以为检测系统的可比性提供支持。

实验室可以通过分析临床大样本数据库，寻找影响特定分析物参考区间的因素，比如：通过大数据分析，促甲状腺激素浓度可能与性别、季节、抽血时间等因素有关[4]。实验室也可以通过实验室信息系统（LIS）间接建立分析物的参考区间[5,6]。

总之，参考区间是体外诊断中定量产品非常重要的一个指标，合理准确的参考区间可以为临床提供有效的信息，有利于临床决策。目前部分上市产品参考区间建立不合理，可能有入组人群不合理，统计方法不恰当等原因，导致检验结果难以解释。定量检测试剂不仅要求检测结果的准确，还要参考区间制定的合理，针对不同的分析物，了解其影响因素，合理分组分别研究，这样检验结果才准确可靠。