不同产地沉香的高效液相色谱指纹特征*

王 茜 尚丽丽 晏婷婷 陈 媛 付跃进 李改云

(中国林业科学研究院木材工业研究所 北京 100091)

沉香为瑞香科(Thymelaeaceae)沉香属(Aquilaria)植物遭遇创伤后在自我修复过程中形成的含有树脂的木材，不仅是传统的名贵药材，有“药中黄金”的美誉，也是顶级的天然香料，被誉为“香中之王”(Bardenetal.，2000)，具有极高的经济价值。由于过度开采，目前沉香属植物均被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)附录Ⅱ，沉香产地溯源可为其合法性提供科学依据。

沉香物种来源丰富，从南亚次大陆的东北部到印度尼西亚群岛、巴布亚新几内亚群岛，分布着至少20余种沉香属植物(Santisuk，2007)。依据产地和气味特征，沉香习惯上被划分为3个产地：产自中国海南、广东、广西等地的沉香被称作莞香系沉香； 产自越南、柬埔寨、老挝等国的沉香被称作惠安系沉香，也有收藏者将中国产沉香划入惠安系(Liuetal.，2017)； 产自印度尼西亚、菲律宾、文莱、马来西亚等地的沉香被称作星洲系沉香。不同沉香产地主要通过气味和滋味依赖经验判断，主观性强，缺乏科学依据(Hashimetal.，2016)。近年来，反映物质所含化学成分信息的直接分析-飞行时间质谱(DART-TOFMS)、液相色谱-质谱(LC-MS)等技术在产地判别上的应用研究日趋增加，结果发现不同产地沉香所含化学成分的组成和含量差异性很大，品质也有较大差别(Espinozaetal.，2013； 李远彬，2017； 贾东宇等，2018)，但尚无法实现产地判别。2-(2-苯乙基)色酮类化合物是沉香的重要指标性成分，对沉香鉴别具有重要意义，尚丽丽等(2018)利用沉香中共有的2-(2-苯乙基)色酮类特征成分建立了适用于野生沉香和人工沉香的高效液相特征图谱鉴别方法，但仅是2-(2-苯乙基)色酮类的部分化合物，仍有大量化合物未被检测和利用。目前，对于来自莞香系、惠安系、星洲系沉香2-(2-苯乙基)色酮类化合物的系统研究尚未见报道。

鉴于此，本研究针对不同地区所产沉香品质差别较大以及传统沉香产地鉴别主要依据经验判断等问题，基于高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)技术进行沉香中2-(2-苯乙基)色酮类化合物的完整分析，筛选不同产地沉香的高效液相色谱指纹特征，并利用指纹特征峰变量进行主成分分析(principal component analysis,PCA)和正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA),建立沉香产地判别方法，以期为沉香资源品质评价与原产地保护提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

36批试验样品采自沉香主产地和市场收集，经中国林业科学研究院木材工业研究所依据LY/T 2904—2017《沉香》鉴定。其中，S1～S12为莞香系沉香，S13～S24为惠安系沉香，S25～S36为星洲系沉香。

沉香四醇对照品(成都菲德生物技术有限公司)，乙腈(色谱纯，美国Fisher公司)，甲酸(色谱纯，美国Fisher公司)，无水乙醇(分析纯，北京化工厂)，超纯水(屈臣氏)。三频数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，植物粉碎机(德国IKA，A11型)，万分之一天平(德国Sartorius公司，R2000型)。

1.2 对照品溶液和样品溶液的制备

按照尚丽丽(2018)对沉香四醇标准品和36批沉香样品进行处理。

1.3 高效液相色谱分析

高效液相色谱仪，包括高压二元泵、紫外检测器、柱温箱、自动进样器和工作站(日本岛津公司)； 色谱柱为Phenomenex luna C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B)； 柱温31 ℃； 检测波长252 nm； 进样量10 μL； 流速1.2 mL·min-1。HPLC梯度洗脱程序：0～7 min，10%～20%A； 7～13 min，20%～25%A； 13～24 min，25%～30%A； 24～40 min，30%～35%A； 40～41 min，35%A； 41～58 min，35%～42%A； 58～82 min，42%～60%A。

1.4 定性分析

超高效液相色谱-四极杆高分辨飞行时间质谱联用仪，包括高压二元泵、二极管阵列检测器、柱温箱、自动进样器和工作站(安捷伦科技有限公司)； 色谱柱、流动相、柱温、进样量、流速和梯度洗脱程序同上； 质谱条件：正离子模式，碰撞气体为氦气，高纯度氮气作为雾化器并进行干燥，流速11.0 L·min-1； ESI源； 毛细管电压3 500 V； 源喷射压力130 V； 干燥气体温度300 ℃； 雾化器压力30 psi； 离子扫描范围为全扫描，扫描范围10～1 000m/z。

1.5 方法学考察

1.5.1 精密度 采用1.2方法平行制备6份样品溶液，在相同HPLC分析方法下进样分析，将所得色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(以下简称相似度评价系统)，以沉香四醇特征峰为参照，计算主要色谱峰相对保留时间的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)。

1.5.2 重复性 采用1.2方法制备沉香样品溶液，取同一样品溶液，在相同HPLC分析方法下连续进样6次，后续操作同上。

1.5.3 稳定性 采用1.2方法制备沉香样品溶液，取同一样品溶液，分别于0、2、4、8、24、36 h在相同HPLC分析方法下进样分析，后续操作同上。

1.6 多元统计分析

基于相似度评价系统分析沉香HPLC数据，以沉香四醇特征峰为参照，对HPLC 图谱其他色谱峰的保留时间和峰面积进行校正。选取时间窗宽度为0.2 min，采用中位数法多点校正自动匹配，寻找共有峰并计算相对峰面积，生成对照图谱进行相似度计算。以共有峰相对峰面积为变量，将数据导入SIMCA-P 14.1软件进行主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)和变量投影重要性(variable importance plot，VIP)分析。

2 结果与分析

2.1 高效液相色谱分离条件的优化与方法学考察

沉香中2-(2-苯乙基)色酮类化合物数量众多，结构相似，沉香四醇等8种化合物是沉香的重要指标性成分，并已针对这些成分建立了适用于野生沉香和人工沉香的高效液相特征图谱(尚丽丽等，2018)。在保持该特征的前提下，本研究经优化色谱柱类型、流动相梯度洗脱程序和流速等分离条件，建立了适宜对沉香中2-(2-苯乙基)色酮类化合物进行完整分析的高效液相色谱方法，见1.3。

精密度试验所得色谱峰的相似度均大于0.99，RSD为0.7%，主要色谱峰相对保留时间的RSD在0.01%～0.14%之间。重复性试验所得色谱峰的相似度均大于0.99，RSD为0.5%，主要色谱峰相对保留时间的RSD在0～0.54%之间。稳定性试验所得色谱峰的相似度均大于0.99，RSD为0.6%，主要色谱峰相对保留时间的RSD在0～0.49%之间。综上可知，方法学考察中主要色谱峰相对保留时间的RSD均小于2%，图谱相似度均大于0.9，说明该方法重复性、精密度良好，样品在36 h内稳定，符合方法验证学要求。

2.2 沉香高效液相色谱的产地特征分析与筛选

36批次不同产地沉香的高效液相图谱经相似度评价系统分析，12批次莞香系沉香共得到65个共有峰(图1)，12批次惠安系沉香共得到29个共有峰(图2)，12批次星洲系沉香共得到36个共有峰(图3)。结合3类沉香的共有峰图谱，将归属于相同化合物的色谱峰编号合并，3个产地共统计出85个特征峰，据此建立不同产地沉香的高效液相色谱指纹图谱(图4)。

图1 12批次莞香系沉香的HPLC图谱Fig.1 HPLC characteristic chromatogram of 12 batches of agarwood of Guan-Xiang Zone

图2 12批次惠安系沉香的HPLC图谱Fig.2 HPLC characteristic chromatogram of 12 batches agarwood of Hoi-An Zone

图3 12批次星洲系沉香HPLC图谱Fig.3 HPLC characteristic chromatogram of 12 batches agarwood of Sin-Chew Zone

图4 不同产地沉香的HPLC指纹图谱Fig.4 HPLC fingerprint chromatogram of agarwood from different origins指纹图谱中3个产地均含有的色谱峰用大写字母A～O(共15个)标注，某2个产地共有峰用小写字母a～p(共16个)标注，产地各自共有峰用阿拉伯数字(共54个)标注。The chromatogram peaks shared by the three origins in the fingerprints are marked with capital letters A-O(15 in total), the peaks shared by a certain two origins are marked with lowercase letters a-p(16 in total), and the peaks shared by each of the three origins are marked with Arabic numerals(54 in total).

图5 不同产地沉香指纹图谱热图Fig.5 Heatmap of chromatogram peaks in agarwood chromatographic fingerprints from different origins

根据指纹图谱中不同产地沉香共有色谱峰信息并结合前期研究结果(尚丽丽等，2018)绘制热图(图5)发现，不同产地沉香的化学成分差异在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4个区域均有体现。Ⅰ区相对保留时间0～7 min，主要成分为沉香专属性成分5，6，7，8-四氢-2-(2-苯乙基)-色酮型色酮(THPECs)(Yangetal.，2016； 尚丽丽等，2018)，3类沉香在该区域各自共有峰出峰时间和数量大致相似，仅在色谱峰强度方面有少许差异，说明不同产地沉香在该区域的化学成分相似，相对含量存在一定差别，其中星洲系沉香样品的沉香四醇特征峰(id：I)响应值极高，可作为星洲系沉香的一个特征； Ⅱ、Ⅲ区相对保留时间18～36 min，主要成分为5，6，7，8-二环氧-2-(2-苯乙基)色酮(DEPECs)和5，6-环氧-2-(2-苯乙基)色酮(EPECs)，这2类色酮被认为是沉香色酮合成过程中的前驱体和早期中间体(Yangetal.，2016)，莞香系沉香富含这2类色酮，惠安系次之，星洲系较少； Ⅳ区域相对保留时间37～85 min，主要成分为沉香中广泛分布的Flidersia型 2-(2-苯乙基)色酮(FTPECs)，莞香系沉香富含较多种类和含量的FTPECs，惠安系次之，星洲系最少。

综上分析发现，不同产地沉香色酮类成分的组成和含量存在较大差异，显示出一定地域性：1) 莞香系样品相似度为0.794～0.939，相似度大于0.8的样品占比91.67%，匹配得到共有峰最多，且共有峰相对峰面积占所有峰面积比例为43.7%，说明莞香系沉香样品间差异较小，共有成分数量和相对含量较一致，且色酮种类和数量最为丰富； 2) 星洲系样品相似度为0.758～0.920，相似度大于0.8的样品占比75%，匹配得到共有峰较多，共有峰相对峰面积占所有峰面积比例为25.5%，共有成分数量较多而相对含量较低，沉香四醇色谱峰极高，其余化合物色酮数量和相对含量均较低，具有鲜明的地域特征； 3) 惠安系样品相似度为0.446～0.888，相似度大于0.8的样品占比31.3%，匹配得到的共有峰数量较少，共有峰相对峰面积占所有峰面积比例为17.0%，说明惠安系沉香色酮种类繁多，组成复杂，THPECs和FTPECs占比较多，个别样品中具有一种高含量的FTPECs(S13)，DEPECs和EPECs相对含量较低，总体色酮相对含量较莞香系稍低，较星洲系稍高。

分析其原因，莞香系沉香树种主要为A.sinensis(董梦妤等，2016)，惠安系沉香树种主要为A.crassna、A.baillonii和A.banaense等(傅婷等，2013)，星洲系沉香树种主要为A.malaccensis和A.filaria(Liuetal.，2017)，不同树种之间的基因差异可能是不同产地沉香品质差异的主要原因。同时，地理环境分隔会阻碍不同种源间的扩展和基因交流，即使是同一谱系，地域之间也存在一定基因差异(Zouetal.，2012)。本研究中，莞香系沉香与星洲系沉香之间色酮类成分差异较大，HPLC图谱差异明显，可能是由于2个产区地理位置分隔较远，基因差异相对较大，而惠安系沉香地理位置基本上处于二者中间，HPLC图谱中，Ⅰ和Ⅳ区色谱峰较莞香系稍少，响应值较高，但Ⅱ和Ⅲ区较星洲系稍多，响应值较低，体现出一定过渡性。此外，沉香品质还强烈依赖于生长地域的地理条件和生态因子，如温度、光照、水分、土壤和海拔等(Tamulietal.，2005; 朱报著等，2014)，气温高、阳光足、降雨量大等外界条件可使沉香结香效果更好(张静斐等，2017)，莞香系、惠安系到星洲系沉香产地地理环境存在纬度逐渐减小、气温逐渐升高、降雨量逐渐增多的趋势，高温多雨的气候条件可能一定程度上会加快植物的新陈代谢，从而影响2-(2-苯乙基)色酮的生物合成过程。

2.3 沉香高效液相色谱产地指纹特征的验证

不同产地沉香高效液相色谱指纹图谱差异为沉香产地判别提供了基础，为了更直观反映利用HPLC指纹特征对沉香产地判别的可行性，进一步结合多变量统计建立沉香产地判别方法。

PCA利用样品在主成分得分上的分布可直观反映出样品化学成分之间的异同，样品聚集度高，表明样品化学成分具有高度相似性，反之，说明存在明显差异。本研究以36批次沉香85个特征峰的相对峰面积为变量进行主成分分析，色酮类共有峰可用5个主成分刻画，累计方差贡献率为62.5%，说明5个主成分对于产地区分的影响力为62.5%。PCA 得分(图6)显示，在前2个主成分二维得分视图平面上，位于左侧的莞香系样品与右侧的星洲系样品可以完全分开，中间的惠安系样品与其他产地有一定重叠，与产地特征分析结果一致，即莞香系、星洲系内部相似度明显大于惠安系。

主成分分析对不同产地沉香显示出一定分类效果，但还无法达到明确区分的目的，因此，本研究进一步采用OPLS-DA建立分类模型，以实现不同产地间的分类和标志性差异化合物的筛选(阿基业，2010)。在全部样品中随机抽取30批次样品作为训练集建立OPLS-DA模型，另外6批次样品不参与建模，作为验证集。模型对训练集和验证集样品的判别正确率均为100%，说明采用36批次来自不同产地沉香的85个特征峰作为产地判别方法的变量是可行的。

利用OPLS-DA建立的判别模型对自变量的拟合指数R2(X)=0.652、对因变量的拟合指数R2(Y)=0.976，表明 65.2%的自变量(共有峰)变化能够解释因变量(产地分类)97.6%的差异，模型主成分回归系数Q2=0.611，大于0.5，表明模型预测能力较强(李远彬，2017； 皮胜玲等，2017； Gaoetal.，2014)，反映出3个产地间具有明确分离的趋势(图7)，与图谱分析中莞香系沉香与星洲系沉香差异明显、惠安系沉香在二者之间具有较为明显的过渡性特征一致。

为了进一步找出对沉香产地分类起贡献作用的变量，制作OPLS-DA模型的VIP图(图8)，VIP代表各变量对模型贡献率的大小，值越大，贡献越大。以VIP大于1为界限进行筛选(陈林等，2017； 柯朝甫等，2014； 李永迪等，2017)，有 34个特征峰变量的VIP>1，说明这34个特征峰变量对不同产地沉香样品分类具有显著影响(李远彬，2017)，可作为不同产地沉香的标志性差异化合物(表1)(Lietal.，2016； Liaoetal.，2018； Meietal.，2013； Naef, 2015； Yangetal.，2016； 杨锦玲等，2014； 张倩等，2015)，选取的特征峰变量具有很好的代表性。

图7 OPLS-DA得分Fig. 7 Score plot in OPLS-DA

图8 特征峰变量的VIPFig.8 VIP value of the characteristic peak variable

续表1 Continued

3 结论

本研究以36批次来自3个不同产地的沉香为研究对象，通过优化高效液相色谱分离条件进行沉香中2-(2-苯乙基)色酮类化合物的完整分析，建立不同产地沉香高效液相色谱指纹图谱。不同产地沉香因树种、地理位置和生态环境等的共同影响，2-(2-苯乙基)色酮类化合物显示出一定地域性，具有独特的高效液相色谱指纹特征。利用HPLC图谱指纹特征结合OPLS-DA，可实现对莞香系、惠安系和星洲系3个不同产地沉香的判别。