白茶中金花菌的分离与鉴定

吴凤 邓有展 秦玉燕 蒋越华 张莉娟 罗义灿 李冬桂

摘 要：金花白茶是白茶中的一种新兴产品。研究金花白茶中金花菌的类型有利于为白茶产业的创新发展提供一定的参考依据。本研究以产自2018年的湖南湘丰牌桑植白茶作为材料，通过平板涂布法及三点接种法分离纯化金花菌，采用形态学观察并联合分子生物学手段对所获得的分离株进行鉴定。分离获得一株金花菌BC-1，经菌落特征、显微形态观察、ITS测序及系统进化树构建，将该菌鉴定为冠突曲霉（Aspergillus cristatum）。从白茶中分离获得的金花菌BC-1为冠突曲霉（A. cristatum），丰富了白茶中金花菌的分类鉴定研究，对金花白茶的开发利用提供一定的参考。

关键词：白茶;金花菌;冠突曲霉;冠突散囊菌;分离;鉴定

中图分类号：TS201.3                   文献标志码：A

Isolation and Identification of Golden Flower Fungus

from White Tea

WU Feng，DENG Youzhan，QIN Yuyan，JIANG Yuehua，

ZHANG Lijuan，LUO Yican，LI Donggui

（Guangxi Subtropical Crops Research Institute， Quality Supervision and Testing Center of Subtropical Fruit and Vegetable， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Nanning， Guangxi 530001， China）

Abstract： Golden flower white tea is a new production of white tea. To study the types of golden flower fungus in golden flower white tea is helpful to provide a theoretical basis for the innovative development of white tea industry. In this study， Hunan Xiangfeng Sangzhi white tea produced in 2018 was used as material， the golden flower fungus was isolated and purified by plate coating method and three-point inoculation method， and the obtained isolate was identified by morphological observation and molecular biological methods. A strain of golden flower fungus BC-1 was isolated and identified as Aspergillus cristatum by colony characteristics， microscopic morphology observation， ITS sequencing and phylogenetic tree construction. The study enriches the research on the classification and identification of golden flower fungus in white tea， and provides a certain reference for the development and utilization of golden flower white tea.

Key words： White tea; golden flower fungus; Aspergillus cristatum; Eurotium cristatum; isolation; identification

白茶屬于我国的六大茶叶类型之一，也是一种微发酵茶。传统的白茶无需杀青或揉捻，只经过包括萎凋、干燥、拣剔等工序制作而成[1-3]。白茶的味道清淡甘甜，起到清热润肺、消炎解毒等多种保健作用[4]，因而深受广大消费者的喜爱。

传统的白茶没有发花工艺，但随着茶叶市场的大热，市面上也出现了带“金花”的白茶。金花白茶源于前人一次偶然下发现了白茶中的“金花”，经过该团队多年研究，通过在白茶工艺上添加使用模拟茯砖茶自然发花过程研制形成金花白茶[5]。随着2018年7月14日金花白茶创新研讨会的成功举办以及金花白茶企业标准的第一次公开发布，金花白茶作为白茶的一个新型产品，有力推动了白茶产业的创新和升级。目前，国内外学者对白茶的研究主要集中在生产工艺、生理生化成分、感官品质以及保健功效等方面[4，6-9]。

茶叶中的微生物种类繁多，在某种程度上会对茶叶的原有品质和风味造成影响。茶叶在国内外市场的大热，使得茶叶中的微生物成为了研究热点之一，出现了大量以茯砖茶等黑茶为代表的金花菌分类鉴定的相关研究报道。根据前人研究报道，金花菌有多种不同的鉴定结果[10-20]，如冠突散囊菌（Eurotium cristatum）、谢瓦散囊菌（E. chevalieri）、雪花散囊菌（E. niveoglaucum）、阿姆斯特丹散囊菌（E. amstelodami）等，最终命名至今尚存在异议，但多数文献以“冠突散囊菌（E. cristatum）”进行报道，也是最为常见的金花菌类型。

大多数人对金花菌的研究主要关注于茯砖、六堡、普洱等黑茶品种上，而对白茶金花菌的研究鲜少报道。金花白茶中的“金花”是模拟茯砖茶发花工艺产生，作为决定金花白茶品质的关键要素之一，与茯砖茶等黑茶中产生的金花菌是否为同一类型，值得大家关注。本研究选用市售某品牌的金花白茶材料进行金花菌的分离鉴定，通过培养基分离纯化金花白茶中的金花，观察培养基上菌落生长情况及形态特征，运用ITS序列进行测序及构建系统进化树，以期从分子水平上初步揭示金花白茶中金花菌的类型，为白茶中金花菌的分类鉴定和白茶的深入研究提供相应的理论基础和依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

实验用茶叶样品为市售的湖南湘丰牌桑植白茶，为2018年生产的白茶紧压茶，净含量为1000 g，茶样见图1。

用于金花菌菌株的分离纯化的马铃薯葡萄糖（PDA）培养基和菌株形态鉴定用的察氏（CZ）培养基，均购于环凯微生物;用于DNA提取的植物基因组DNA提取试剂盒、用于PCR产物纯化的通用型DNA纯化回收试剂盒、琼脂糖等物品和试剂均购于天根生化，2×EasyTaq■PCR SuperMix （+dye ）、DNA Maker等购于北京全式金。

1.2 主要仪器设备

洁净工作台、霉菌培养箱、高压蒸汽灭菌锅、普通光学显微镜、普通PCR扩增仪、电泳仪、离心机、电动研磨仪、凝胶成像系统。

1.3 实验方法

1.3.1 白茶样品金花菌的分离纯化

白茶茶样中金花菌的分离按照GB 4789.15-2016国家标准中的方法一进行操作[21]，机械粉碎茶样材料，在无菌条件下称取粉碎的茶样材料25 g，加入225 mL已灭菌的磷酸缓冲液，充分振摇混匀，按10倍递增系列稀释，吸取100 uL稀释度为10-5、10-6、10-7的稀释液，使用涂布棒均匀涂布在PDA培养基上，28℃培养5天，选取典型的黄色单菌落进行多次划线分离纯化直至获得单一纯化菌株[17]。

1.3.2 菌株的形态学观察

将已纯化的金花菌菌株按照三点接种法分别转接至PDA和CZ培养基上，28℃培养5天，记录不同培养基上的菌落形态特征;挑取CZ培养基中微量菌丝，观察及拍照该菌株的典型显微形态特征。

1.3.3 白茶金花菌的分子鉴定

1.3.3.1 菌株基因组DNA的提取

刮取少量新鲜培养的菌丝于已灭菌的试管，加入液氮后使用电动研磨仪迅速将菌丝研磨至粉末状，之后按照天根植物基因组DNA提取试剂盒说明书上的实验步骤提取DNA。

1.3.3.2 ITS序列的扩增及测序

采用真菌通用的ITS引物[22]对提取的菌株DNA进行PCR扩增，引物序列详细信息如表1所示，由上海生工合成。PCR反应体系：DNA模板1.0 μL，2×EasyTaq PCR■SuperMix （+dye ）（全式金）12.5 μL，引物各0.5 μL，加无菌水补足至25.0 μL。电泳检测PCR产物，凝胶成像系统拍照。之后使用天根通用型DNA纯化回收试剂盒纯化的PCR产物后送到上海生工测序。PCR反应条件和扩增程序设定如下：

预变性：94℃      5 min

变性： 94℃      30 s

退火： 58℃      30 s            35 cycle

延伸： 72℃      30 s

终延伸：72℃      10 min

保存： 4℃        60 min

1.3.3.3 系统进化树的构建

使用NCBI数据库中的BLAST对测序所获的ITS序列进行同源性比对，下载数据库中相似度较高的同源序列，运用MEGA 7.0.14版本进行序列比对和系统进化樹的构建（Neighbor-joining方法，Bootstrap验证，P-distance模式，随机搜索设为1000）。

2 结果与分析

2.1 白茶金花菌的形态特征

将获取的金花菌菌株编号BC-1。该菌株在PDA培养基上生长较慢，培养5天菌落直径为22～25 mm（图2-A、2-B），正面看整个菌落呈圆形，菌落质地致密，有放射性脊，颜色分层明显类似于同心圆状，边缘为浅黄色辐射状，中间部分颜色较深，从外到里呈浅黄色、深黄色至黑褐色，菌落黑褐色部分向外渗出黑色水滴状液体;反面看菌落从外到里呈金黄色、深黄色、黑褐色，颜色逐步加深。该菌株在CZ培养基上生长较快，培养5天菌落直径为26～30 mm（图2-C，2-D），正面看整个菌落均呈金黄色蓬松绒状，中间微隆起，有放射性脊;反面看菌落中间接种点呈黑褐色，由里向外从深黄色变成金黄色。刮取少量菌丝在显微镜下观察，可看到大量近圆球状的黄色闭囊壳（图2-E），这些黄色闭囊壳中包裹了许多球状子囊，破裂后会释放出来，进而产生大量的子囊孢子（图2-F）。

2.2 白茶金花菌的分子鉴定及系统进化树构建

使用ITS通用引物对提取的BC-1金花菌株DNA进行PCR扩增，经电泳检测显示（图3），所扩增的PCR产物条带单一明亮，位于500～600 bp之间，与预期结果相符。将测序所获ITS序列在NCBI上进行同源比对并构建系统进化树（图4），结果表明，白茶金花菌株BC-1的ITS序列（登录号：OM250369.1）与NCBI数据库中的Aspergillus cristatum（登录号：MH496725.1、MG659640.1、MG659637.1、KX858811.1）相似度高达100%，而且菌株在系统进化树上属同一分支。以序列相似程度≥97%划分为同一个操作分类单元（OTU）原则[23]作为参考依据，本研究从金花白茶中分离的菌株BC-1与Aspergillus cristatum为同种微生物，结合菌株BC-1的菌落及显微形态特征，可将其鉴定为冠突曲霉（A. cristatum）。

3 讨论

真菌的形态特征复杂，不同环境条件下某些真菌的形态特征和生殖方式可能会发生改变，因而单单采用形态学鉴别真菌容易影响结果的准确性。随着DNA测序技术的快速发展，核酸序列分析被广泛应用于微生物的分类鉴定中，其中ITS片段因其长度和序列变化较大，在真菌的分类鉴定中获得普遍应用。本研究对市售的湖南湘丰牌桑植白茶中的分离纯化获得的金花菌菌株BC-1进行菌落及显微形态特征鉴定，表明该菌具有金花菌的典型特征，ITS序列测序结果表明金花菌菌株BC-1与冠突曲霉（A. cristatum）高度相似，且在系统进化树上属于同一个分支，得出该金花白茶的金花菌株BC-1为冠突曲霉（A. cristatum）的结论。这与陈勇强[5]的“福鼎”白茶的研究结果相同。

金花菌存在有性型和无性型两种繁殖方式，例如冠突曲霉（A. cristatum）为有性型，而冠突散囊菌（E. cristatum）为冠突曲霉（A. cristatum）的无性型。目前金花菌的鉴定和命名有较大争议，比如鉴定是同一种菌应当以有性型还是无性型进行命名;其次是金花菌属于哪一种。多数茶学研究者通过试验研究表明了金花菌为冠突散囊菌（E. cristatum）[10-12]。呂嘉枥等认为陕西茯砖茶中有谢瓦散囊菌（E. chevalieri）、冠突散囊菌（E. cristatum）、阿姆斯特丹散囊菌（E. amstelodami）、肋状散囊菌（E. costiforme）4种优势金花菌[14，15]。胡治远等认为湖南产区茯砖茶样品中优势微生物主要有上述4中散囊菌还有蜡叶散囊菌（E. herbariorum）等散囊菌属真菌[16];欧惠算、毛彦、陈然等人分别从不同的六堡茶样品中分离得到阿姆斯特丹散囊菌（E. amstelodami）[17]、雪黄散囊菌（E. niveoglaucum）[18]、冠突散囊菌（E. cristatum）[19];邓秀娟等通过illumina Miseq测序技术发现了普洱茶中存在雪黄散囊菌（E. niveoglaucum）[20]。上述学者们在茯砖茶、六堡茶、普洱茶等黑茶中发现了不同类型的金花菌，也说明黑茶中的金花菌具有多样性。

金花白茶作为一种新兴产品，金花数量成为了衡量金花白茶品质的重要指标之一。本研究通过对金花白茶中的金花菌进行分离鉴定，确定该金花白茶中的金花菌为冠突曲霉（冠突散囊菌的有性型），这与茯砖茶中的冠突散囊菌鉴定结果一致[10-12]，本研究结果为白茶中金花菌的分类鉴定和开发利用提供相应的理论依据，也为探讨白茶中的微生物及其作用、促进白茶产业的发展提供一定的参考依据。

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