哺乳动物性别决定及相关基因研究进展

谢晓刚，贾燕青，仇薪鑫，罗 艳，张振仓，李 丹，马乃祥*，权富生*

(1.杨凌职业技术学院动物工程分院，陕西杨凌 712100；2.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100)

动物的性别是指伴随着有性生殖的出现，在生物界同种个体之间普遍出现的一种形态和生理上的差异现象，它是由于减数分裂以及配子融合从而基因组发生重组的结果，对真核生物来说是非常普遍的，包含了一系列复杂的机制[1]。

哺乳动物性别决定(sex determination)是指其在有性繁殖过程中，形成了性别分化，并在其种群内形成了有差异的雌、雄个体。在精子和卵子受精之后，受精卵开始发育，存在于性染色体上性别决定基因开始起作用，使得受精之后胚胎逐渐形成了雄性和雌性的性别差异。从遗传学角度来看，则是在有性生殖生物中决定雌、雄性别分化的机制[2]。哺乳动物性别决定一直以来都是生命科学领域的研究热点，但是到目前为止，其具体的的调控机制仍然不太清楚。

对于二倍体脊椎动物来说，后代的性别是由父本贡献的性染色体所决定的。在大多数情况下，尤其是对于哺乳动物来说，个体的性别决定在受精时就会形成[3]。动物的性别决定机制可以分为两种，即遗传性别决定和环境性别决定。遗传性别决定一般都是由位于性染色体上的决定基因启动一系列性别相关基因参与的分子信号通路，从而诱导原始性腺发育成雄性或者雌性生殖腺的过程[4]。

随着近些年科学工作者对对哺乳动物性别决定机制的深入研究，发现了一系列与性别决定和性别分化相关的基因及信号通路，它们在动物性别决定、性腺分化以及生殖和发育等生物学过程中起重要作用。本文介绍了几种研究最广的哺乳动物性别决定相关因子。

1 Zfy和Zfx基因

除了极少数个体之外，绝大多数的动物都是雌雄异体，参与动物的性别决定、性腺发育及分化的相关基因及其具体调控机制复杂多样。Y染色体在精子发生和性别决定中起重要的作用。位于哺乳动物Y染色体短臂(Yp)上的Zfy(Y chromosome linked zinc-finger protein transcriptional factor，Y染色体相关锌指蛋白转录因子)基因，当初一经发现，就被认为是最重要的性别决定基因(sex determining gene)之一[5]。近些年来，随着科学工作者对Zfy基因的深入研究，其在哺乳动物性别决定及精子形成过程中的重要作用被逐渐阐明。

Zfy基因是位于Y染色体短臂(Yp)上一个相关的锌指蛋白转录因子，其基因家族还包括位于X染色体上的Zfx基因和位于常染色体上的Zfa基因。Zfy基因在哺乳动物圆形精子细胞中高表达[6]。Zfx/Zfy这一对等位基因是一对具有高度保守性的旁系同源基因，同源性很高。在小鼠中，已经鉴定得到了2个Zfy基因，即Zfy1基因和Zfy2基因，都位于Y染色体短臂上，在小鼠的性别决定及精子形成过程中具有重要的作用[7]。而在人类、牛、羊等动物的Y染色体上，均只有一个Zfy基因。

Zfy蛋白包含12个～13个锌指结构，其前面是大的酸性活化结构域并且具有修饰的反式激活潜力，其产生一个保守的编码锌指蛋白的睾丸特异性转录物，其在各种生物学过程中起重要的作用，包括基因的表达、分化和胚胎发育等[8]。在减数分裂期间，Zfy1基因的的功能与Zfy2基因不同，在减数分裂性染色体失活(meiotic sex chromosome inactivation，MSCI)中，Zfy1基因缺少一个外显子，其编码的酸性区域(acidic domain)约为Zfy2之前占主导地位的酸性区域的一半[9]。Zfy1在睾丸中存在可变剪切，并产生两种不同的转录本，分别是全长型转录本和一个缺乏主要酸性结构域外显子的睾丸特异性短型转录本。短型转录本是减数分裂前精原细胞的主要变体，而长型转录本是减数分裂后精子细胞的主要变体。在人类中，有且只有一个Zfy基因拷贝，其功能类似于小鼠的Zfy1基因，也就是说，人类Zfy产生两种不同的转录变体，全长形式和缺乏主要酸性域外显子的睾丸特异性短型形式[9]。鉴于Zfy基因的这种睾丸特异性剪接在人和小鼠之间是保守的，Zfy基因在牛羊等动物中很可能也存在长型和短型两种剪接变体。与其旁系同源基因Zfx基因不同，Zfy基因与性别鉴定密切相关。近些年的研究表明，Zfy2基因是小鼠次级精母细胞有效完成第二次减数分裂的必要条件[10]，使得小鼠次级精母细胞能够产生单倍体圆形精子细胞，对于精子头部重组，以及精子尾部发育具有重要的作用[11]。此外，Zfy基因在减数分裂性染色体失活、小鼠精子的发生、受精和殖繁过程中具有重要作用[7]。SRY、Eif2s3y和Zfy2作为3个关键基因，在人工受精中精子功能的获得和产生小鼠后代上也具有重要作用[12]。

Zfx基因被认为是受X染色体失活的保守旁系同源基因。Zfx基因在干细胞中广泛表达并控制胚胎和造血干细胞的自我更新[13]。在第二次减数分裂阶段，一个Y型二倍体精子细胞可以发育为两个Y型圆形精子细胞(Ⅷ)，然后产生两个Y精子。具有转录功能的锌指基因在单倍体精子细胞和Y精子中具体称为Zfy。Zfy基因的mRNA水平在精子发生周期的第Ⅷ阶段达到一个峰值[14]，而Zfx基因其表达峰值在Ⅰ-Ⅻ阶段。X精子和Y精子之间存在平衡，在此期间，受精后会诱导后代性别比例的平衡[3]。

近年来，有一系列研究表明，利用RNA干扰(RNA interference，RNAi)的方式降低Zfy基因或者Zfx基因mRNA的表达量，来破坏单倍体精子的发育，可以引起后代性别比率的偏移，作为一种控制后代性别比例的方法，其已经在小鼠，以及牛、绵羊、马鹿[15-16]等家畜动物上实现。此外，基因编辑技术作为一种重要的基因功能研究方法，随着近些年来其快速发展，也为研究牛羊Zfy基因的功能、探索一种新的研究方法来控制牛羊后代的性别比例提供了便利，将为牛羊等家畜动物的种群繁殖和稳定性奠定良好基础。

2 SRY基因

SRY(sex determining region of Y chromosome，Y染色体性别决定区)基因也是位于Y染色体短臂(Yp)上的特异性性别决定基因，是目前公认的睾丸决定因子(testis determining factor，TDF)，在哺乳动物的性别决定中具有重要的作用，是哺乳动物性别决定的总开关。

1990年，Sinclair A H等人在人体内克隆到Y染色体上一个特异性性别决定基因，即SRY基因[17]。随后几年，在很多动物体内均发现了SRY基因，其长度为35kb左右，编码79个氨基酸，SRY蛋白含有一个典型的DNA结合结构域，即高泳动类非组蛋白(high mobility group，HMG)盒基序，类似于已知的转录因子，所以推测SRY编码一个转录因子[18]。HMG也是SRY基因主要的功能区，研究发现，人与哺乳动物的HMG区域的同源性高达70%。有研究发现，在人体内SRY基因仅在生殖嵴中的一小部分细胞中表达并启动雄性发育[19]。在小鼠体内，SRY基因仅在生殖嵴的中心区域低表达，SRY基因随着小鼠性腺的发育表达量递增，性腺开始分化后SRY基因将停止表达[20]。

SRY基因的发现是哺乳动物性别决定研究过程中的一个里程碑，为家畜动物动物早期性别鉴定奠定了理论基础。作为传统的性别决定因子，SRY基因在性别控制(sex control)上的研究一直受到人们的追捧。1991年，Koopman P等将一段含有SRY基因的序列导入到小鼠胚胎内，在出生的小鼠中，部分染色体为XX型的雌性小鼠会出现性别反转，成为雄性，其大小和体重与正常小鼠相比没有明显不同，与野生型雌性小鼠相比，其交配方式也无明显不同，然而小鼠失去了生殖能力，不能产生后代[21]。2012年，中国农业科学院北京畜牧兽医研究所的吴宁等人利用RNA干扰技术，构建了靶向小鼠性别决定基因——SRY基因的干扰载体，通过在对怀孕母鼠和受精卵的注射之后发现，SRY基因的沉默显著影响了小鼠性腺和睾丸的发育，且位于常染色体上与性别有关的基因WT1基因显著升高[22]。2013年，Kato T等利用TALEN技术结合原核注射技术生产出了敲除SRY基因后代小鼠，发现SRY基因敲除的雄性小鼠出现了性别的转化，既基因型为XY型的小鼠出现了完全的雌性表型，具有像雌鼠一样的内生殖器等，但是这些小鼠是不育的，与正常小鼠交配不能产生后代，且SRY基因的敲除影响了性腺的发育[23]。2017年，Song Y等人的研究发现Sp1基因可以作为SRY基因转录的主要调控因子，Sp1基因的突变会导致实验兔子性别发生反转[24]。

可以发现，SRY在性别决定过程中具有重要作用，SRY基因的导入也可以实现动物性别的转化，然而其个体的生殖能力会受到影响，不能产生后代，使得很难将SRY基因应用于家畜性别控制中。

3 Sox9基因

Sox9基因，即SRY-盒包含蛋白9(sex determining region Y-box 9)基因，是SRY-盒包含蛋白(SRY-type HMG box，sox)基因家族的重要一员，是继SRY基因之后发现的又一个重要的性别决定基因，近些年来，逐渐引起了人们的关注。研究表明，Sox9基因在哺乳动物的生殖调控中起着重要的作用，参与胚胎性别分化、精子发生等一系列的的生殖活动。

哺乳动物性别决定是一个复杂而又连续的生理过程，多种基因和转录因子参与其中。Sox9基因是Sox基因家族E亚族的一个重要成员，不仅存在于高等哺乳动物，甚至于在低等无脊椎动物如水母中也广泛存在[25]。近些年来，随着基因研究水平的不断提高，科学工作者相继发现Sox9基因作为一个重要的转录调控因子，在哺乳动物各个组织中广泛存在，除性别决定外，还调控着很多关键的生理、病理过程，如胰腺发育、软骨形成、软骨细胞分化、神经角质细胞发育、肿瘤等疾病发生等。

作为一个潜在的性别决定因子，Sox9基因在哺乳动物胚胎发育时期的性别分化过程中起着重要的作用，如睾丸的发生、抑制向雌性分化、雄性支持细胞和间质细胞的分化等过程[26]。在哺乳动物中，Sox9基因是SRY基因主要的的靶向目标，它对睾丸支持细胞的分化至关重要，通常有其他转录因子一起参与，尤其是Sox8和Dmrt1基因。2006年，Barrionuevo F等研究发现，在上游基因SRY基因缺失的状况下，Sox9基因可以诱导雄性小鼠睾丸的发育[27]。2018年，Nitzan Gonen等人的研究表明，通过对Sox9基因的一个末端增强子13做靶向敲除，可以使拥有XY型染色体的雄性小鼠转变为雌性，产生卵巢，同时没有睾丸和体腔血管发育的迹象[28]。除了这些作用之外，Sox9基因在出生后哺乳动物睾丸支持细胞增殖、精子发生、睾丸间质细胞增殖等哺乳动物生殖活动中也起着重要的调控作用。

位于哺乳动物Y染色体上SRY基因在性腺的未分化阶段开始表达，在初级性别决定中可诱导未分化的性腺向睾丸方向分化[29]，但是其表达非常短暂。而Sox9基因作为SRY基因主要的下游靶基因，被SRY基因激活后可以持续表达，通过进一步激活相关信号通路来调控雄性性腺的发育[30]。在哺乳动物体内，Sox9基因具有很高的保守性。然而，其在染色体上的位置及结构特点因物种的不同而异。如人类的Sox9基因位于17号染色体的17q24.3-25.1区域内，长度为3 934 bp[31]；猪的Sox9基因位于染色体12p13-p11区域内，编码509个氨基酸，具有一个高迁移率族蛋白(high mobilty group，HMG)结构域，可以编码71个氨基酸残基(104-174位)[32]；牛的Sox9基因位于19号染色体上，含有一个1 575 bp的开放阅读框(ORF)，可以编码524个氨基酸残基，编码蛋白不含跨膜区和信号肽[33]。

4 Dmrt1基因

Dmrt1(double-sex and map-3 related transcription factor l)基因是哺乳动物、爬行动物、鸟类、鱼类和果蝇体内广泛存在的一类基因，是已知最保守的一个哺乳动物早期性别决定以及性腺分化相关的转录因子，是近些年发现的又一个雄性胚胎专一性表达基因。其是SRY基因和Sox9基因之后被发现的又一个重要的性别决定相关基因，是控制睾丸分化的必须基因之一。有研究表明，Dmrt1基因在小鼠早期胚胎发育过程中，在雌雄个体均有表达，但是随着胚胎的不断发育，其在在雄性性腺中的表达量逐渐升高，而在卵巢中表达量却逐渐降低[34]。Dmrt1基因位于小鼠常染色体的9p末端区，在小鼠体内敲除Dmrt1基因之后，会导致小鼠性分化的异常。Dmrt1基因与MAB3和DSX具有同源性，有研究发现Dmrt1、MAB3、DSX基因只在胚胎的生殖嵴上表达[35-36]。在各种物种体内，Dmrt1基因都具有一个保守的DNA结合结构域。Dmrt1基因对于哺乳动物雄性性腺的形成及其功能的维持具有重要的作用。此外，Zhang等人的研究发现，Dmrt1基因在哺乳动物精原干细胞的维持过程中也具有重要作用[37]。

5 WT1基因

WT1基因，即威尔氏瘤抑制基因1(Wilms tumor gene 1)。人类的WT1基因位于11p13，小鼠的WT1基因位于17号染色体上。人类的WT1基因通过可变剪切以及不同的起始翻译位点，产生24种不同的蛋白异构体。WT1基因在人类未分化的生殖嵴以及睾丸分化的性索内表达，在哺乳动物早期性腺及睾丸的发育过程中发挥关键作用。WT1基因可以产生8种不同的DNA锌指结构蛋白，WT1蛋白常常通过识别目标基因上游特异性的DNA序列来调节基因的转录，WT1蛋白的序列分析表明，羧基端有3个锌指结构与转录因子Egr1和Sp1具有高度的同源性，而SRY的GC盒中含有2个在不同物种间高度保守的Sp1结合位点，推测WT1可能通过这2个位点活化SRY启动子的转录[38]。

有研究发现，小鼠WT1蛋白可直接与Dax1启动子TATA盒附近富含GC序列相结合，从而使之激活。WT1可以抑制细胞的分裂和分化，在间质细胞形成精巢的过程中有一定作用。在哺乳动物的睾丸内，WTl基因在足细胞中表达；而在卵巢中，WTl基因在颗粒细胞中表达，而足细胞和颗粒细胞均可以促进哺乳动物生殖细胞发育成熟。有研究发现，WT1基因的突变会导致出现Denys-Drash综合征，在46个XY型染色体个体中引起了部分和完全的性别反转，表明WT1基因可能参与性别分化早期SRY基因的激活[39]。Parker等人的研究发现，从泌尿生殖嵴到双向分化潜能性腺发育过程中，WT1基因的突变会影响精巢和卵巢的发育。2007年，Caignec C等人的研究表明，WT1基因的突变会导致新生胎儿后肾胚芽的异常增生，从而导致肾脏肿瘤的发生，并进一步发现该基因与WAGR综合症的发生密切相关[40]。2010年，Gao Q等人的研究发现，在小鼠体内敲除WT1基因之后，会导致小鼠性腺的缺乏，从而使得XY型雄性小鼠的生殖器逐渐发育为雌性特征，同时肾上腺和脾脏发育受损，这表明WT1基因在调节性腺形成过程中的关键作用[41]。

6 展望

综上所述，哺乳动物的性别决定是由多个基因、信号通路所共同参与的一个复杂而又精密的时序性调控过程。性别决定在动物的生命历程占有很重要的地位，科学工作者一直在试图探索其具体的调控机制，所取得的成果也不断的丰富着我们对新的性别决定系统的认识。

近些年来，随着分子生物学技术的不断发展，人们对基因功能的研究取得了很大的突破。通过对一些基因的研究，逐渐发现了很多与哺乳动物性别决定相关的基因，除了上述提到的性别决定基因之外，还有诸如SF1、Gata4、DAX1、AMH、FGF9、Sox8基因[42]等。性别决定是由多个基因相互协作的过程，其中任何一个性别决定基因的缺失或突变，都将对动物个体的性别决定产生很大的影响，最终导致性别决定出现障碍。如今，虽然已对哺乳动物的性别决定机制研究已经取得了一定的进展，但是目前得到的这些仍然是不系统的、不完整的，这就要求我们要不断去探索，去发掘一些潜在的性别决定基因及相关的信号通路。相信随着科学研究的不断深入，借助各种新的分子生物学技术，在不久的将来，哺乳动物的性别决定机制这个谜底必将被揭开，从而促进哺乳动物配子发生、胚胎发育、器官形成等研究领域的快速发展，为畜牧业生产以及人类疾病的研究带来新的希望。