高效液相色谱法测定饲料添加剂吡咯喹啉醌二钠含量

胡朝阳

（福建省产品质量检验研究院，福建 福州 350002）

吡 咯 喹 啉 醌 （ pyrroloquinoline quinone，PQQ） 是继烟酰胺和核黄素后于微生物中发现的又一种氧化还原酶辅酶， 广泛存在于原核生物、植物和哺乳动物的生物组织中。 PQQ 具有抗氧化、 促进神经生长因子再生等多种功能。 在饲料应用中， 吡咯喹啉醌二钠盐 （PQQ-2Na） 是吡咯喹啉醌 （PQQ） 的最常用形式。 相关研究表明， 吡咯喹啉醌二钠盐具有较强的抗氧化能力，能够调节蛋鸡机体的抗氧化能力和代谢能力，促进蛋鸡尤其是初生蛋鸡的早期发育生长能力，因此作为饲料添加剂在饲料中有着广泛的应用前景。

目前， 吡咯喹啉醌的测定方法主要是高效液相色谱法 （HPLC）， 针对的是吡咯喹啉醌纯物质。 饲料添加剂中吡咯喹啉醌二钠盐的检测还未见报道。 本文建立了高效液相色谱法测定饲料添加剂吡咯喹啉醌二钠。 该方法简单快速，重现性好， 适用于饲料添加剂吡咯喹啉醌二钠的定量检测， 可为饲料添加剂生产企业、 饲料添加剂监督部门及进出口检测部门提供技术支持。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260 高效液相色谱仪配光电二极管阵列检测器 （美国安捷伦科技有限公司）； DS-8510 超声波发生器 （上海生析超声仪器有限公司）； 分析天平 （赛多利斯北京有限公司）； Milli Q 超纯水制备器 （美国密理博有限公司）。 乙腈（色谱纯， 山东禹王实业有限公司）， 其它试剂均为分析纯。

对照品： 吡咯喹啉醌二钠 （PQQ-2Na， 纯度86.5%） 由福建优佰福生物科技有限公司提供。

1.2 溶液配制

稀释液： 称取1.13g 磷酸氢二钠和0.95g 磷酸二氢钠溶解于500mL 纯水中。

流动相盐溶液： 称取3.87g 四丁基溴化铵和1.632g 磷酸二氢钾溶解于600mL 纯水中。

标准储备液的配制： 准确称取吡咯喹啉醌二钠对照品各0.1501g， 用稀释液溶解并定容至100mL， 配制得浓度均为1.30mg/L 的标准储备液。

标准工作溶液的配制： 将吡咯喹啉醌二钠的标准储备液采用逐级稀释法用稀释液配制浓度为0.2mg/L、 0.5mg/L、 1.0mg/L、 5.0mg/L、 9.8mg/L、49.0mg/L 的系列标准工作溶液。 所有标准储备液和标准工作溶液置于冰箱中于0℃～4℃温度下保存。

1.3 样品预处理

称取饲料添加剂样品 0.1g （ 精确至0.0001g） 于25mL 具塞比色管中， 加入8mL 稀释液， 置于超声波振荡器中超声萃取20min， 用稀释液定容至刻度线并混匀， 以水相滤膜过滤，滤液供分析用。

1.4 高效液相色谱条件

色 谱 柱： Welch ultimate XB -C 18 柱（4.6mm×250mm， 5 μm， 月旭科技 （上海） 股份有限公司)。 柱温： 35℃。 流动相： 乙腈 （A） -流动相盐溶液 （B） =40/60 等度洗脱； 洗脱时间： 12min； 进样量5 μL； 检测波长249nm。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择和优化

2.1.1 检测波长的选择

为了考察检测波长对目标化合物检测灵敏度的影响， 利用DAD 检测器在210nm～800nm波长范围内对标准溶液进行扫描， 得到吡咯喹啉醌二钠的紫外—可见分光谱图 （见图1）。 为消除溶液中有紫外吸收的杂质在低波长处的干扰， 最终选择249nm 作为检测波长。

2.1.2 色谱柱和流动相的选择

实 验 比 较 了 Silversil C18柱 （ 4.6mm ×250mm， 5μm）、 和Welch ultimate R XB-C18柱（4.6mm×250mm， 5μm） 这2 种分析柱以及不同流动相体系对吡咯喹啉醌二钠的分离效果 （见图2）。 实验结果表明， 当流动相体系为乙腈/水时， 目标物在Welch ultimate R XB-C18柱上无法出峰 （见图2A）； 当流动相体系为乙腈/流动相盐溶液时， 在Welch ultimate R XB-C18柱上可得到较理想的分离效果， 吡咯喹啉醌二钠色谱峰的灵敏度高且出峰时间适宜 （见图2B）；在Silversil C18柱上达到基线分离， 但出峰较靠前， 可能受杂质峰干扰， 影响定量 （见图2C）。因此本文选用Welch ultimate R XB-C18柱作为分析柱， 以乙腈/流动相盐溶液为流动相进行梯度洗脱检测。

图1 吡咯喹啉醌二钠的紫外—可见光谱图

图2 采用不同色谱柱和不同流动相时吡咯喹啉醌二钠的色谱图

2.2 线性方程、 线性关系、 检出限及定量限

配制吡咯喹啉醌二钠浓度为13.0mg/L 到520mg/L 之间的系列混合标准工作溶液， 以峰面积对浓度进行线性回归， 线性方程、 相关系数见表1。 结果表明， 吡咯喹啉醌二钠在13.0mg/L～520mg/L 内具有很好的线性关系， 相关系数r 为0.9997， 方法定量限完全能满足饲料添加剂中吡咯喹啉醌二钠的检测要求。

表1 吡咯喹啉醌二钠的回归方程、相关系数、线性范围

表2 饲料添加剂样品加标回收率实验结果（n＝3）

2.3 方法回收率和精密度

在优化后的检测条件下， 取空白基质酵母粉样品进行加标回收率测试， 加标水平分别为5.2%， 10.4%， 20.8%， 每个水平重复分析3 次，结果见表2。 从表2 中可知， 该方法的加标回收率范围为101.7%～102.2%， 相对标准偏差RSD范围为0.7%～3.6%， 结果表明， 该方法适用于饲料添加剂中吡咯喹啉醌二钠的日常分析检测。

2.4 稳定性

取标准曲线范围内13.0mg/L、 130mg/L 和520mg/L 三个质量浓度的吡咯喹啉醌二钠标准溶液， 于室温下放置2h， 4h， 6h， 8h， 12h 和2～6天， 考察吡咯喹啉醌二钠标准溶液日内和日间稳定性。 实验结果表明， 低、 中、 高三个质量浓度的吡咯喹啉醌二钠标准溶液日内稳定性的精密度分别为0.2%～0.9%、 0.1%～0.5%和0.1%～0.9%， 日间稳定性的精密度分别为0.2%～1.3%、0.1%～0.8%和0.1%～1.1%。 由此可见， 吡咯喹啉醌二钠日内和日间稳定性均较好， 有利于实验的进行。

3 结论

本文采用高效液相色谱法对饲料添加剂吡咯喹啉醌二钠含量进行分析检测。 该方法采用稀释液超声萃取， 过膜上机， 操作简单快速，适合饲料添加剂样品的大批量前处理。 实验结果表明， 所建立的饲料添加剂吡咯喹啉醌二钠具有良好的精密度和回收率， 方法日内和日间稳定性均较好， 完全能够满足饲料添加剂中吡咯喹啉醌二钠的日常监测。 该方法简便快速，重现性好， 适用于饲料添加剂中吡咯喹啉醌二钠的定量检测， 可为饲料添加剂生产企业、 饲料添加剂监督部门及进出口检测部门提供技术支持。

参考文献 （略）