耕作方式对山地烟田烤烟根际土壤真菌群落结构的影响

童文杰，杨敏，王皓，封幸兵，张留臣，周彬，陈峰，马二登，李军营，徐照丽，李庆鹏，黄飞燕，陈小龙，蔡永占，余磊，邓小鹏*

1 云南省烟草农业科学研究院，昆明 650201； 2 昆明学院/云南省都市特色农业工程技术研究中心，昆明 650214；3 中国烟叶公司，北京 100055； 4 中国烟草总公司云南省公司，昆明 650011；5 河南中烟工业有限责任公司原料采购中心，郑州 450000；6 云南省烟草公司曲靖市公司，云南曲靖 655000

耕作是农业生产中必不可少的一个重要环节，不同的耕作方式对土壤结构（团聚体、容重、孔隙度和紧实度）、养分特性（氮、磷、钾和有机质）及微生态环境（微生物数量、微生物多样性、土壤酶活性）等均有影响[1-2]，合理的耕作方式不仅能优化土壤结构、改善土壤理化特性，还有利于创造适宜作物生长的根际微生态环境，是作物高产、稳产的前提[3]。土壤微生物是土壤微生态系统的重要组成部分，参与着土壤的有机质转化、养分循环以及肥力形成[4]，对土壤环境变化敏感，能较早地表征土壤质量和生态功能的变化，常作为评判土壤生态系统健康的重要指标[5]。研究表明，土壤中主要微生物的数量和种类明显受不同耕作措施的影响[6]，且不同耕作方式导致的土壤环境改变亦会造成土壤微生物群落结构、组成和多样性发生改变[3]。如研究发现，免耕田的养分含量较高且微生物群落独特[7]，且免耕处理的群落多样性均略高于翻耕处理[8]；但在黏土中，深耕和秸秆还田对增加土壤微生物的丰度更有效[9]；此外，播种前进行深翻、深松处理后旱地小麦根际土壤细菌、真菌、放线菌的数量均高于免耕处理[10]。可见，受作物种类及栽培管理措施的影响，不同作物根际土壤微生物群落变化受不同耕作方式的影响不同，因此，探究不同耕作方式对山地烟田烤烟根际土壤微生态环境的影响，对改进山地烟田传统耕作模式、缓解烟草连作障碍具有重要的理论与实际意义。

云南地处中国西南边陲，植烟土壤多以山地烟田为主，“酸”、“黏”、“瘠”、“旱”是云南植烟土壤的重要特征[11]。目前云南山地烟田耕作方式多以旋耕、浅翻耕为主，长期单一的耕作模式导致植烟土壤板结紧实、犁底层变厚上移、耕层变浅等一系列问题日益凸显。研究发现，翻耕和深松措施可有效打破土壤犁底层降低土壤容重[12-13]，同时将上茬作物以及其他植物残留物翻进更深土层，既有利于增加土壤肥力、提高土壤通透性，又能为土壤微生物提供大量的养料，对促进土壤微生物生长，改善土壤微生态环境有积极作用[14]。目前，深耕和深松措施改善山地烟田土壤理化性质、优化烤烟根系空间分布构型，以及对烟叶生产的提质增效作用均已被证实[15,16]。但深耕、深松措施对云南山地烟田土壤微生态环境的影响以及作用机理目前尚不明确，因此，本研究采用Illumina MiSeq 高通量测序技术分析不同耕作处理烤烟根际土壤真菌群落结构和多样性的差异，旨在从根际微生态角度分析深耕、深松措施对山地烟田土壤提质增效的作用机理，同时为深耕、深松措施在云南山地烟田的应用提供有益参考。

1 材料与方法

1.1 试验区概况

试验于2018 年3—9 月在云南省玉溪市红塔区高仓街道（24°30′N，103°32′E）进行。该地区为云南滇中烟区典型山地烟种植区域，耕地主要以缓坡地或台地为主。试验地土壤类型为红壤土，前茬作物为小麦，耕地前0～20 cm 土层土壤基础性状为：pH6.72，有机质17.8 g·kg-1，全氮0.75 g·kg-1，全磷1.28 g·kg-1，全钾7.7 g·kg-1，水解性氮79.1 mg·kg-1，有效磷37.4 mg·kg-1，速效钾204 mg·kg-1，供试烤烟品种为K326。

1.2 试验设计和田间管理

采用单因素随机区组排列试验设计，共设置4 个试验处理：旋耕20 cm（RT20，对照），利用旋耕机刀片切削、打碎土块，疏松混拌耕层土壤，旋耕深度20 cm；深耕30 cm（DT30），通过904 东方红拖拉机三点悬挂铧式犁深翻耕地，深耕深度30 cm；深松30 cm（ST30）、深松40 cm（ST40），通过904 东方红拖拉机三点悬挂凿式深松铲疏松土壤而不翻转土层，利用拖拉机液压控制深松机高度，控制深松深度分别为30 cm、40 cm。深耕、深松完成后，将烟田细耙整地，至土垡细碎。设每处理3 次重复，共12个小区，各小区面积为108 m2（7.2 m×15 m）。烤烟常规单垄移栽，行距1.2 m，株距0.6 m，移栽后垄高25 cm，病虫害防治及其他田间管理措施参照当地优质烟叶生产管理办法执行。

样品采集：于旺长期在各小区按五点取样法选取烟株，去除表层土后将烟株整株拔起，抖落较松散的土壤，然后收集附着在根上0～4 mm 间的土壤作为根际土，去除土样中的杂物、细根后混匀放入自封袋中，于-80℃冰箱内保存 （各小区采集土壤单独保存），用于土壤微生物的测定。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 土壤真菌多样性的测定

（1）基因组DNA 的提取和PCR 扩增

参 照FastDNA®SPIN Kit for Soil（MP，USA）土壤基因组DNA 提取试剂盒的步骤提取各根际土壤样品 DNA，DNA 浓度和纯度利用NanoDrop2000 进行检测，利用1% 琼脂糖凝胶电泳检测DNA 提取质量。使用引物ITS1 F（5’-ACTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’）和ITS2 R（5’-BGCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’） 对18S rRNA 基因的ITS-1 可变区进行PCR 扩增，扩增程序为：95℃预变性3 min，36 个循环（95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45s），最后72℃延伸10 min。扩增体系为20 μL：4 μL 5*FastPfu 缓冲液；2 μL 2.5 mmol·L-1dNTPs；0.8 μLForward Primer（5 μmol·L-1）；0.8 μLReverse Primer（5 μmol·L-1）；0.4 μLFastPfu 聚合酶；0.2 μL BSA；10 ng DNA 模板；加ddH2O 至20 μL。使用2%琼脂糖凝胶回收PCR 产物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit （Axygen，USA）试剂盒进一步纯化回收后，送上海美吉生物医药科技有限公司进行MiSeq 测序。

（2）下机数据的质控与分析

原始测序序列使用Trimmomatic 软件质控，用FLASH[17]软件进行序列拼接；通过Usearch 软件（Version 7.0）过滤得到的序列，并去除嵌合体序列得到有效序列；用 Uparse[18]软件（Version 7.1）在 97% 的相似性水平上划分操作分类单元；代表序列用 RDP classifier 软件[19]和 SILVA[20]数据库进行物种注释，利用Mothur 软件（version v.1.30.1）作稀释度曲线，计算文库覆盖率（Coverage），Shannon、Simpson、ACE 及Chao1 指数，对物种的多样性和丰富度指数进行评价；利用Qiime 软件（Version 1.7.0）建立的Bray-Curtis 距离算法进行主坐标分析（PCoA）。

1.4 数据处理

采用excel 软件进行数据处理；采用spss 22.0 数据处理系统进行统计分析，并利用Duncan’s 新复极差法进行数据的多重比较和分析。

2 结果与分析

2.1 真菌的OTU 丰度和Alpha 多样性

在97%相似水平上不同耕作处理根际土壤样品真菌群落OTU 丰度和多样性指数如表1 所示，OTUs丰度稀释度曲线显示（图1），随着测序数量的上升，稀释度曲线斜率逐渐下降，趋向平坦，说明测序数量足够。覆盖率（Coverage）是指样本中序列被检测出的概率，其值越高，代表本次测序结果越符合样本中微生物的实际情况，在本试验中，4 个处理的覆盖率均大于99.0%（表1），表明测序读长足以进行此项分析。

图1 不同耕作处理烤烟根际土壤真菌Shannon指数稀释度曲线Fig. 1 Shannon index-based rarefaction curves of fungus in rhizosphere soils under different tillage treatments

图2 不同耕作处理烤烟根际土壤真菌OTUs 分布韦恩图Fig. 2 Venn graph of fungus OTUs distribution in rhizosphere soils under different tillage treatments

表1 不同耕作处理烤烟根际土壤真菌OTU 丰度和Alpha 多样性Tab. 1 Fungus OTU abundance and alpha diversity index in rhizosphere soils under different tillage treatments

由表1 可知，深耕和深松处理较常规旋耕相比有利于提升烤烟根际土壤中真菌OTU 丰度，DT30、ST30 和ST40 三个处理OTU 丰度分别较RT20 处理提升了9.19%、13.11%和6.32%。真菌OTUs 分布韦恩图表明，四个处理根际土壤中一共有4479 个OTUs（图2），四者共有的OTUs 仅为580 个，只占OTUs 总数的12.95%；各耕作处理所特有的OTUs数表现为DT30（151 个）＞ST30（137 个）＞RT20（116个）＞ST40（111 个），DT30、ST30 处理所特有的OTUs 数分别是RT20 的1.30 倍和1.18 倍，可见不同耕作处理烤烟根际土壤真菌群落在OTUs 水平上存在明显差异。此外，深耕和深松措施还对烤烟根际土壤真菌群落的丰富度和多样性均有影响，与RT20 相比，DT30、ST30 和ST40 三个处理的Shannon 指数分别提升了8.23%、7.46%和4.63%，同时，Simpson指数分别降低了31.08%、20.11%和17.55%，说明，深耕和深松措施有利于提升烤烟根际土壤真菌群落多样性（Shannon 指数值越大，Simpson 指数值越小，群落多样性越高）；除群落多样性外，深耕和深松处理的真菌群落丰富度也有不同程度的提升，DT30、ST30 和ST40 三个处理的Chao1 指数分别较RT20 提升了8.27%、13.39%和4.26%，ST30 处理的ACE 指数较RT20 提升了3.37%。

DT30、ST30 和ST40 三个处理之间真菌OTU丰度和Alpha 多样性亦表现出差异，在同一耕作深度（30 cm）下，DT30 处理的真菌群落多样性略高于ST30 处理，但ST30 处理的OTU 丰度大于DT30处理，且ST30 处理真菌群落丰富度亦高于DT30 处理，其ACE 和Chao1 指数分别较DT30 处理升高了4.76%和4.72%；此外，两个深松处理的OTU 丰度、所特有的OTUs 数、以及Shannon 指数、ACE 指数和Chao1 指数均表现为ST40 处理＜ST30 处理。总体看来，耕作方式以及耕作深度均会对烤烟根际土壤真菌OTU 丰度和Alpha 多样性产生影响。

2.2 真菌的群落种类组成及相对丰度

各处理根际土壤样品中真菌在门（Phylum）和属（Genus）分类水平上物种相对丰度堆积柱形图如图3、4 所示。由图3 可知，不同耕作处理烟株根际土壤真菌区系在门水平上主要由子囊菌门（Ascomycota） 和被孢霉门（Mortierellomycota）组成，二者均占各耕作处理总量的90%以上。进一步分析各处理之间的差异发现，DT30、ST30和ST40 处理能提升烤烟根际土壤中子囊菌门（Ascomycota）和壶菌门（Chytridiomycota）的相对丰度，而降低被孢霉门（Mortierellomycota）和担子菌门（Basidiomycota）的相对丰度。与RT20 相比，DT30、ST30 和ST40 处理的子囊菌门（Ascomycota）相对丰度分别增加了1.51%、3.63%和7.00%；壶菌门（Chytridiomycota）的相对丰度分别增加了920.00%、440.00%和220.00%；同时，三个处理的被孢霉门（Mortierellomycota） 相对丰度分别降低了9.57%、35.80%和47.55%；担子菌门（Basidiomycota）的相对丰度分别降低了45.57%、21.52%和40.51%。

DT30、ST30 和ST40 三个处理之间门水平上真菌群落相对丰度亦表现出差异，DT30 处理的子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）的相对丰度均低于ST30 和ST40 处理；但被孢霉门（Mortierellomycota）和壶菌门（Chytridiomycota）的相对丰度却明显高于ST30 和ST40 处理，其中，DT30 处理的被孢霉门（Mortierellomycota）和壶菌门（Chytridiomycota）的相对丰度较ST30 处理分别增加了40.85%和88.89%；较ST40 处理分别增加了72.40%和218.75%。此外，同一深松处理下，随着耕作深度加深，除子囊菌门（Ascomycota）相对丰度表现为ST30＜ST40 外，其余真菌群落均表现为ST30＞ST40。

图3 不同耕作处理烤烟门水平上的真菌相对丰度柱形图Fig. 3 The relative abundance of fungus on Phylum level in rhizosphere soils under different tillage treatments

进一步分析不同耕作处理烤烟根际土壤真菌区系属水平上的差异发现（图4），镰刀菌属（Fusarium）真菌为实验地烤烟根际土壤中主要真菌类群，在各耕作处理真菌类群中所占比例均最大，但不同耕作处理间镰刀菌属（Fusarium）相对丰度表现为RT20（19.61%）＞ST30（16.76%）＞ST40（16.00%）＞DT30（14.64%），与RT20 相 比，ST30、ST40 和DT30 处理的镰刀菌属（Fusarium）相对丰度分别降低了14.53%、18.41%和25.34%；此外，DT30 处理的镰刀菌属（Fusarium）相对丰度较ST30 和ST40处理分别降低了12.65%和8.50%。茎点霉属（Phoma）真菌具有很强的纤维素酶活性，大部分是植物病原菌，不同耕作处理间茎点霉属（Phoma）相对丰度变化趋势与镰刀菌属（Fusarium）相同，表现为RT20（3.69%）＞ST30（2.54%）＞ST40（2.46%）＞DT30（2.40%），与RT20 相比，ST30、ST40 和DT30 处理茎点霉属（Phoma）相对丰度分别降低了31.17%、33.33%和34.96%；DT30 处理较ST30 和ST40 处理分别降低了5.51%和2.44%；此外，同一深松处理下，ST40 相对丰度较ST30 降低了3.15%。

与镰刀菌属（Fusarium）和茎点霉属（Phoma）变化趋势相反，青霉属（Penicillium）和紫霉属（Purpureocillium）真菌的相对丰度在DT30、ST30和ST40 处理中有不同程度的增加，与RT20 相比，DT30、ST30 和ST40 处理青霉属（Penicillium）相对丰度分别增加了18.84%、27.90%和51.45%，紫霉属（Purpureocillium）相对丰度分别增加了153.62%、115.94%和28.99%。

图4 不同耕作处理烤烟属水平上的真菌相对丰度柱形图Fig. 4 The relative abundance of fungus on genus level in rhizosphere soils under different tillage treatments

根据各样品在种水平的物种注释及相对丰度信息，选取丰度排名前50 的物种，生成群落Heatmap图，由图5 可知，在已被准确分类命名的物种中，镰刀菌属（Fusarium）真菌主要分布于茄病镰刀菌（Fusarium solani） 和 层 出 镰 刀 菌（Fusarium proliferatum），茎点霉属（Phoma）真菌主要分布于广生茎点霉（Phoma omnivirens），大量研究表明，以上三者均是重要的植物病原真菌，危害作物种类众多，但不同耕作处理间茄病镰刀菌（F. solani）相 对 丰 度 差 异 表 现 为DT30＞RT20＞ST40＞ST30，层 出 镰 刀 菌（F. proliferatum） 相 对 丰 度表 现 为ST30＞RT20＞DT30＞ST40， 广 生茎 点 霉（P. omnivirens） 相 对 丰 度 表 现 为RT20＞DT30＞ST40＞ST30，说明，深耕和深松处理对降低烤烟根际土壤中土传病原微生物数量有一定的积极作用。此外，深耕和深松还能在一定程度上促进土壤中有益微生物的生长，如紫色紫孢菌（Purpureocillium lavendulum）是一类重要的线虫生防真菌，不同耕作处理中其相对丰度表现为DT30＞ST30＞ST40＞RT20。总体看来，耕作方式对烤烟根际土壤真菌群落结构、物种组成及相对丰度均有较大影响。

图5 不同耕作处理烤烟种水平上的真菌群落分布热图Fig. 5 The fungal community heat map on genus level in rhizosphere soils under different tillage treatments

2.3 真菌群落组成的PCoA 聚类分析

采用Bray-Curtis距离算法进行PCoA主坐标分析，主成分1（PC1）和主成分2（PC2）对样品差异性的解释度分别为20.95%和18.56%，两者总计可解释全部土壤样品的39.51%。由图6 可知，DT30、ST30和ST40 处理烤烟根际土壤真菌群落分布在第一、二和四象限，而RT20 处理则单独分布在第三象限，三个处理均与对照间隔距离较远，说明常规旋耕处理的烤烟根际土壤真菌群落组成与深耕和深松处理有较大差异。进一步分析深耕和深松处理之间的差异发现，DT30 和ST30 处理的烤烟根际土壤真菌群落均分布在第一、二象限，二者相隔距离相对较近且有重合，说明在同一耕作深度下，深耕和深松处理之间真菌群落组成差异不大；但同一深松措施下，ST40 处理真菌群落主要分布在第二、四象限，与ST30 处理基本平行且间隔一定距离，可见处理深度亦对真菌群落组成有较大影响。

图6 不同耕作处理烤烟根际土壤真菌群落组成的PCoA 分析Fig. 6 PCoA cluster analysis of fungus community in rhizosphere soils under different tillage treatments

3 讨论

土壤微生物是土壤中最活跃的生物体，对土壤环境变化敏感，在一定程度上反映着土壤质量和生态功能的变化，土壤微生物多样性和群落结构稳定性是评判土壤生态系统健康的重要指标[21]。根际土壤微生物多样性与植物健康密切相关，较低的土壤微生物多样性易导致植物土传病害的发生[22-23]，而高微生物多样性和活性有利于促进植物生长[24-25]、增强植物自身抗性，从而抑制土传病害的发生[26]。

本研究中深耕（DT30）和深松（ST30，ST40）三个处理的真菌OTU 丰度均大于常规旋耕（对照，RT20）处理，且DT30、ST30 处理所特有的OTUs 数也较RT20增加，分别为RT20的1.30倍和1.18倍；其次，DT30、ST30 和ST40 三个处理的Shannon 和Chao1 指数亦较RT20 有不同程度的提升，显示山地烟田进行深耕和深松处理有利于提升烤烟根际土壤中真菌群落的多样性和丰富度。对稻田土的研究表明，深耕和深松能把地表的杂草及植物残体等翻进土层，既能提高土壤的通透性，又能为土壤微生物提供大量的养料，其土壤微生物的数量及多样性均有明显提升[20,27]，本研究结论与之一致。

除微生物多样性外，深耕和深松措施对山地烟田烤烟根际土壤真菌群落组成及分布均有一定影响：PCoA 主成分及群落分析表明，常规旋耕（对照，RT20）处理与深耕（DT30）、深松（ST30，ST40）处理烟株根际土壤真菌在门、属和种水平上的优势菌群和相对丰度均有显著差异。本研究中镰刀菌属（Fusarium）真菌在各耕作处理真菌类群中所占比例均较大，为优势真菌类群。不同耕作处理中镰刀菌属（Fusarium）相对丰度表现为：深耕、深松处理＜旋耕（对照）处理；从种的分类水平看，不同耕作处理烤烟根际土壤中镰刀菌属（Fusarium）真菌主要为茄病镰刀菌（F. solani）和层出镰刀菌（F. proliferatum），大量研究表明，这两种真菌均是烤烟镰刀菌根腐病的主要致病菌[28-29]，本研究结果表明深耕和深松措施对降低两种病原菌的相对丰度表现出积极效应。此外，茎点霉属（Phoma）真菌也是一类重要的植物病原菌，常造成农作物的茎腐、枝枯、叶片和果实坏死等病害，其中广生茎点霉（P. omnivirens）可侵染烟草茎秆和叶片引起烟草茎点病，对烟草植株危害严重[30]。在本研究中不同耕作处理广生茎点霉（P. omnivirens）相对丰度表现为RT20＞DT30＞ST40＞ST30，表明耕作方式不同对于烤烟根际土壤中土传病原微生物的数量具有一定影响。

同时，本研究中青霉属（Penicillium）和紫霉属（Purpureocillium）真菌相对丰度均表现为：深耕、深松处理＞旋耕（对照）。青霉属（Penicillium）真菌可参与有机物的分解，促进C、N、P 等多种元素的循环，还能降解多种环境有害物质；紫霉属（Purpureocillium）中紫色紫孢菌（P. lavendulum）是一类重要的线虫生防真菌，两类有益微生物的增加对优化烤烟根际真菌群落结构以及改善微生态环境均有积极意义。

4 结论

土壤微生态环境与土壤微生态系统的能量流动、信息传递及物质循环密切相关，良好的土壤微生态环境是维持土壤肥力和养分供应能力的基本前提，也是保障土壤质量健康的重要基础。与山地烟田传统的旋耕模式相比，深耕和深松措施常对土壤耕层结构造成较大的影响，有利于提高土壤的通透性，创造有益于土壤微生物生长的微环境，对促进土壤微生物的多样化生长、提升土壤微生物多样性和丰富度均有积极作用；且深耕和深松过程中打破了传统旋耕、浅翻耕耕作模式下的微生物群落结构，促进了微生物群落结构的重建，对土传病原微生物的生长表现出较明显的抑制作用，有利于重塑稳定和多样化的根际土壤微生物群落结构，营造健康的根际微生态环境。说明，深耕和深松措施对改善山地烟田土壤微生态环境有一定的积极作用，研究可为深耕、深松措施在云南山地烟田的利用提供一定的科学依据。