猪流行性腹泻病毒在美国的流行及其检测方法的研究进展

陈梅娟，张志诚，李继东

(1.宁夏大学农学院,宁夏 银川 750021；2.中国动物卫生与流行病学中心,山东 青岛 266032)

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)为尼多病毒目、冠状病毒科、α-冠状病毒亚属成员[1]，可引起新生仔猪发生以急性腹泻、呕吐、脱水和高死亡率为特征的接触性肠道传染病，即猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)。20世纪70年代初，PED首次出现在英国，随后迅速传至西班牙等其他欧洲国家[2]。2013年5月 美国首次发现PED，且其迅速传播，导致美国31个州的商业猪存栏数量在18个月内损失10%[3]。PEDV作为一种感染猪并导致高死亡率的冠状病毒，虽无直接证据表明其和目前全球流行的新型冠状病毒SARS-CoV-2有直接关联，但其作为冠状病毒科、α-冠状病毒亚属成员，在遗传变异、致病力、传播扩散以及宿主选择等方面存在极大的不确定性，同时其也是国际贸易，尤其是当前中美生猪及猪肉贸易中具有重要检疫意义的病原微生物。为此，本文在分析美国猪群PED监测和检测情况的基础上，对PEDV病原学、检测方法等方面的研究进行综述，以期为从美国的生猪及猪肉制品入境及其检疫监测技术提供支持。

1 PEDV简介

1.1 病原学 PEDV基因组是单股正链RNA，基因组全长约28 kb，主要由3个部分组成，包括5′端非编码区(5′-UTR)，3′端非编码区(3′-UTR)，7个开放阅读框(ORF1a，ORF1b，ORF2～6)[4]。ORF共编码16种非结构蛋白、4种结构蛋白和1种辅助蛋白。基因的顺序分别为：5′-ORF1(1a/1b)-S-ORF3-E-M-N-3′。ORF1a和ORF1b是位于5′端的2个重叠的开放阅读框，约占据病毒全基因组的2/3，ORF1a和ORF1b共同编码的多聚蛋白(Polyprotein，PP1ab)在翻译后期被程序性切割而产生16种非结构蛋白(Nsp1～Nsp16)，主要参与病毒的复制和转录过程。ORF2、ORF4～6分别编码4个结构蛋白(S、M、E、N)，其中S蛋白是PEDV的主要表面抗原，能够介导病毒进入宿主细胞，并且刺激宿主产生中和抗体；M蛋白为跨膜蛋白，在病毒装配以及出芽的过程中起到重要作用；E蛋白是PEDV病毒粒子中最小的结构蛋白，主要参与病毒的组装并在病毒的出芽期发挥重要作用；N蛋白具有高度的保守性，其抗原决定簇是诱导机体免疫的重要组成成分，可诱导强烈的细胞免疫反应。ORF3编码辅助蛋白，与PEDV的细胞适应性及病毒毒力有关，并且ORF3基因序列分析可以用来区分疫苗和野生型PEDV[5]。然而，Wang等[6]研究发现，在低致病性弱毒疫苗株中，ORF3基因的49 bp缺失将不再是区分经典减毒疫苗和野毒株的可靠标准。目前已知的PEDV仅有1个血清型，但是根据S基因可以将PEDV分为1型基因群(G1)和2型基因群(G2)，每种基因群中均可分为2个亚型，分别为G1a与G1b亚型和G2a与G2b亚型。

1.2 传播途径 患病猪是PEDV的主要传染源。此外，携带PEDV的野猪是病毒的储存宿主，对该病的流行和传播具有重要作用[7]。PEDV主要通过直接或间接接触以及气溶胶进行传播。粪-口途径，即通过直接接触感染猪的粪便和/或呕吐物传播，是PEDV传播的主要途径。PEDV在农场内和农场之间的间接接触传播也很频繁，特别是在生物安全性较低的情况下，通过其他受污染的媒介传播，如运输拖车、农场工人的手、靴子和衣服、饲料、饲料成分和添加剂以及用于运输散装饲料的包装袋等[8]。粪便-鼻腔途径是PEDV通过气雾化形成颗粒，这种病毒颗粒在哺乳猪中具有传染性，是该病传播的另一种途径[9]。

2 PEDV在美国的流行

2.1 流行史 PED最早于1971年在英国被记录为1种类似于传染性胃肠炎的疾病。1978年，PED的病原在比利时被鉴定为1种新的冠状病毒，并被命名为PEDV，原型株为CV777[2]。20世纪70—80年代，PEDV在欧洲广泛传播，如英国、比利时、捷克共和国、匈牙利、法国、瑞士、德国和意大利等国家均有报道。在亚洲，这种病毒于1982年首次在日本被发现，并传播到包括韩国、中国、泰国和越南在内的几个国家和地区，由于其对养猪业的影响较小，并未引起人们足够的重视。2010年，PEDV毒株变异导致PED发病率显著提高，造成大量哺乳仔猪死亡，给养猪业造成了严重损失后，学者们才开始对PEDV的突变和重组进行深入的研究。2013年，PEDV传入北美，最初在美国发现，随后传播到加拿大和墨西哥。2014年夏季，乌克兰暴发猪流行性腹泻疫情，10日龄以下仔猪受到严重影响，死亡率接近100%[10]。随后，在德国、葡萄牙、法国、荷兰、意大利和比利时也发现了与仔猪水样腹泻相关的PED暴发[11]。如今，PED已经成为世界范围内的流行病，分布在德国、越南、日本、美国等国家和地区，给全球养猪业造成了巨大的经济损失。

2.2 PEDV在美国的流行状况 2013年5月，美国爱荷华州暴发了PED，对历史样本的检测则显示，此前1个月俄亥俄州就已发生了PEDV感染。到2014年9月底，PEDV在全国范围内迅速传播，并在32个州的农场得到证实[12]。这次疫情的暴发导致超过700万头仔猪死亡，造成9亿～18亿美元的经济损失。截至2017年12月，已经有39个州和超过3 750个场所被确认为PEDV阳性[13]。在美国，PED是由PEDV的2个不同基因型(G)引起的，即S INDEL(G1b)和非S INDEL(G2b)毒株[12]。而且有学者发现，美国的所有PEDV毒株都聚集在2a亚组的1个分支中，并与来自中国的1个毒株(AH2012)密切相关[14]。Su等[15]从2016—2017年在美国采集的猪粪便和口腔液样本中检测到4种类型的PEDV变异株，这些变异株的S蛋白存在大量缺失，同时还检测到美国CV777毒株，这是美国首次发现S1 NTD-del PEDV变异株与美国原型毒株的共感染现象。2017年2月，Zhang等[16]在俄克拉荷马州1个 母猪养殖场发现1种PEDV变异株(USA/OK10240-8/2017)，全基因组序列分析表明，其S基因N端结构域有1个连续的600nt(200aa)缺失，这是美国首次在临床猪样本中检测到PEDVS基因的大片段缺失。冠状病毒S基因的突变，尤其是碱基的插入和缺失，可能会改变冠状病毒的致病性、抗原性和组织嗜性，并且变异毒株的不断出现，也为PEDV的防控增加了难度。

美国猪病监测报告系统(Swine Disease Reporting System,SDRS)2020年的分析[17]显示，2019—2020年度美国养殖猪群中的PEDV阳性率分布维持在1个较为宽泛的统计区间。2019年上半年各月份监测结果显示，PEDV的核酸检测水平与2018年度同期持平，所有年龄组的阳性检出率均略为下降。2019年9月份PEDV的阳性检出率为12.98%，与8月份基本一致。其中成年/母猪养殖场的PEDV阳性检出率为5.24%，为PEDV进入美国以来的历史最低水平。但在10—12月份，PEDV 阳性检出率则持续上升。2019年12月，PEDV阳性检出率升至15.64%。12月1—14日，PEDV RNA的检测水平高于历史同期预期水平，这可能主要是由爱荷华州市场的断奶动物病例增多造成的。2020年1月份PEDV阳性检出率较2019年12月份有较大幅度上升，其中明尼苏达州和北卡罗来纳州的阳性检出率最为显著，而2020年2—5月的监测显示，各州中猪各年龄组的PEDV阳性检出率都有所下降，可能和这期间兽医公共卫生服务强度及猪群监测范围大小和取样数量等有一定关联。总体上看，PEDV在养殖猪群中的分布随生猪出栏数量、生长育肥阶段和各地区养殖状况不同而有较大差异。

Bowman等(2015年)[18]和Scott等(2016年)[19]研究认为，美国PEDV的发生是养殖猪群的感染发生在先，然后传播扩散到了野生猪群，这一结论的证据是野生猪群监测的PEDV核酸阳性要比养殖猪群的PEDV核酸阳性的出现晚1年以上。为了调查美国现阶段野生猪群PEDV的感染状况，Bevins等[20](2018年)用基于全病毒建立的PEDV-ELISA检测方法，对来自美国37个州的7 997份野猪血清样品进行了检测，结果发现共有253份血清样品呈冠状病毒阳性，阳性率为3.2%。由于PEDV-ELISA方法对猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)产生交叉反应，所以又使用了基于PEDV S1蛋白建立的荧光微球免疫分析(FMIA)检测方法对这253份阳性样品进行了额外的筛查，其中8份呈PEDV阳性，阳性率为0.1%，另外245份阳性样品可能感染了TGEV。

2.3 其他冠状病毒 冠状病毒科由4个属组成：α冠 状病毒、β冠状病毒、γ冠状病毒和δ冠状病毒。α属的代表性成员有PEDV、TGEV、猪呼吸道冠状病毒(Porcine despiratory corouavirus,PRCV)、猪急性腹泻综合征冠状病毒(Swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)。δ属的成员有猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)。PEDV、TGEV和PDCoV感染猪后主要引起肠道感染，PRCV易感染呼吸道。猪感染肠道冠状病毒对猪群健康危害极大，但其对公共卫生的不确定性影响只是近期才被广泛关注。TGEV于1946年在美国首次报道，能够引起猪的传染性胃肠炎，常导致2周龄以内的哺乳仔猪因呕吐和严重腹泻而死亡[21]。虽然TGEV和PEDV经常发生共感染并导致严重的流行性疾病，但是这2种病毒抗原性不同，不存在交叉保护。PRCV最早于1984年在比利时发现，是TGEV的S基因缺失突变毒株[22]，形态学上与TGEV相似，主要在扁桃体和呼吸道复制，可以引起猪肺炎。2014年，在美国腹泻猪中检测到1种新的δ冠状病毒，即PDCoV，临床表现与PEDV、TGEV感染相似。生产中多见由PDCoV与PEDV、TGEV混合感染导致的猪腹泻性疾病。PDCoV基因组结构与PEDV等冠状病毒相似，但与PEDV基因排列顺序不同的是PDCoV的NS6位于M基因和N基因之间，NS7位于N基因的ORF中[23]]。2016—2017年，在中国的腹泻猪中发现了另1种新的α冠状病毒(类似于bat-HKU2)，它的基因组序列与PEDV等冠状病毒的序列存在差异，但在临床上与其他病毒感染相似，被命名为SADS-CoV[24]。

3 PEDV的检测方法及其选择

3.1 检测方法的研究

3.1.1 环介导等温扩增技术(LAMP)LAMP是一种简单、特异、经济高效的核酸扩增方法。Yu等[25]为了在缺少设备的猪场实现快速检测，建立了PEDV实时RT-LAMP 检测方法，最低可检测的病毒量为0.07 PFU，比一步法RT-PCR敏感100倍，与实时RT-PCR 敏感性相当。然而，在LAMP试验中使用的荧光染料常常会引起假阳性结果，且开盖检测很容易发生气溶胶污染。随后，有学者针对以上问题，将垂直流(VF)核酸检测试纸条置于可视化条带盒的密封塑料装置中以控制扩增中产生的污染，并与RT-LAMP检测技术相结合，建立了RT-LAMP-VF PEDV检测方法，该方法有较好的特异性，检测最低限为10 pg RNA，可在PEDV临床诊断中推广应用[26]。随着检测要求的不断提高，Zhou等[27]建立的微流控RT-LAMP芯片检测系统，可同时检测和鉴别诊断PEDV、PDCoV和SADS-CoV，特异性为100%，敏感性分别为92.24%、92.19%和91.23%，最低检测限分别为10拷贝/μL，并且其快速、便携、低成本的特点，适合在偏远地区推广。

3.1.2 免疫层析技术(ICA)ICA是20世纪末发展起来的一种快速诊断技术。为了对PEDV感染做出早期诊断，进而采取严格的生物安全措施以及疫苗接种等措施以控制PEDV的传播和蔓延。Liu等[28]研发了基于聚苯乙烯Eu(III)螯合物微粒的横向流动试纸条(LFTSs)，可定量分析粪便拭子中的PEDV N蛋白。该方法的敏感性和特异性为97.8%和100%，最低病毒检测限为10 TCID50/mL。为了降低背景荧光的干扰性，Xu等[29]研发了基于EuNPs-mAb荧光探针的免疫层析试纸条(ICA)，该方法最低可检测病毒量为2.725×103TCID50/mL，样品检测与RT-PCR的一致性为86.67%。除了适用于PEDV抗原检测的方法，还有学者建立了可检测初乳中PEDV抗体的免疫胶体金检测方法。Liu等[30]以纯化的G2基因型PEDV-LNCT2颗粒作为捕获抗原，建立了可检测初乳样品中PEDV抗体的免疫胶体金检测方法。这种方法不仅可以同时检测G1和G2基因型毒株，还能通过测定SIgA水平监测猪群感染和免疫状态，为PEDV流行病学监测和疫苗免疫研究提供了简便、灵敏、特异的检测手段。

3.1.3 聚合酶链式反应检测技术(PCR)常规和实时逆转录聚合酶链反应(rRT-PCR)等分子诊断方法与传统的其他方法相比具有更高的诊断敏感性和特异性，是实验室诊断PEDV的首选方法。美国大多数兽医诊断实验室在收到临床样本后24 h内报告rRT-PCR结果，因此可以快速实施干预和控制措施，以降低病毒进一步传播的风险。当前PEDV在全球逐渐呈现经典和变异毒株共同流行的复杂态势，为PEDV的诊断和防控增加了一定的难度。Su等[31]根据此流行态势建立了新型的基于TaqMan探针的双重实时RT-qPCR，用于检测和区分PEDV经典和变异毒株。随着仪器的革新和纳米技术的应用，多种PCR优化及衍生方法被建立，如Luo等[32]建立的基于功能化磁珠富集和特异性纳米技术扩增的双重超灵敏纳米粒子DNA探针的PCR(dual UNDP-PCR)方法，能同时检测和鉴别诊断PEDV和TGEV。双重UNDP-PCR对PEDV和TGEV单次或多次感染的检出限为25拷贝/g，比目前已知的双重RT-PCR敏感性高400倍，表现出更好的特异性和敏感性，且不与其他病毒发生交叉反应。目前，基于PCR的检测方法主要用于检测疑似感染该病毒动物的粪便、直肠拭子或肠道样本中的PEDV基因组。为此，Puente等[33]建立了RT-qPCR方法，能够快速选择性检测热处理后可能感染的PEDV，用于推断其传染性，在养猪业饲料成分监测方面也具有潜在应用价值。

3.1.4 酶联免疫吸附试验(ELISA)ELISA是免疫学检测中应用最广泛的方法之一，一直被作为血清学检测的标准方法，可用来检测PEDV的抗原和抗体。PEDV捕获ELISA试剂盒已被开发用于检测粪便样本中的PEDV。然而，临床样本中病毒的检测可能受到几个因素的影响，包括样品采集的时间、样品储存条件和运输温度。因此，建议在感染急性期，即出现临床症状后不久就采集样本，并低温运送至实验室。有研究者建立了间接ELISA来评估口腔液中是否存在PEDV特异性IgG和IgA抗体[34]。Okda等[35]建立并验证了几种检测PEDV抗体的血清学检测方法，包括基于N蛋白的间接和阻断ELISA。结果表明，这些方法之间具有良好的相关性，并呈现出类似的诊断敏感性和特异性(iELISA分别为97.9%和97.6%；bELISA分别为98.2%和98.0%)。与间接ELISA相比，阻断ELISA的主要优点是其特异性更高，其检测特异性取决于阻断抗体的亚型及其对靶抗原的特异性。

目前建立的间接ELISA方法，一般是通过原核表达系统表达重组病毒蛋白(S、N 和 M)，用于包被抗原的大量生产。但是，使用原核表达系统表达的蛋白质可能缺少适当的蛋白质折叠以及翻译后修饰(例如糖基化)，进而影响蛋白的生物活性，这可能导致ELISA试剂盒的敏感性和特异性降低。针对这个问题，Chang等[36]在人胚胎肾(HEK)-293细胞分别表达S基因的全长及其截断蛋白，以此建立了2种间接ELISA方法，与基于N蛋白的商用ELISA试剂盒相比，基于全长S蛋白的ELISA的敏感性为97.8%，特异性为94%，基于截断S蛋白的ELISA的敏感性更高，为98.9%，特异性为99.1%。目前建立的用于PEDV诊断的间接ELISA方法，非常耗时且昂贵，而纳米抗体其易于表达和高度稳定性的优势可以克服这些问题，为此Ma等[37]建立了基于生物素化的纳米抗体新型封闭ELISA(bELISA)，并用该方法对150份临床血清样品进行了检测，bELISA的灵敏度和特异性分别为100%和93.18%，与商用ELISA试剂盒的符合率为94%。

3.2 检测方法的选择与评估 猪的4种肠道冠状病毒感染引起的临床症状难以区分。因此，鉴别诊断是控制猪病毒性腹泻的关键技术环节。特别是对区间移动以及生猪和猪肉贸易中的风险控制与口岸监测筛查而言，选择合适的检测试剂和方法，是降低PEDV传入风险的最重要手段。敏感性更高的诊断测试可以提供更高的置信度来解释样品的污染/感染状态，故而最低检测限-分析敏感性(Analysis sensitivity,ASe)和临床诊断敏感性(Diagnosis sensitivity,DSe)在监测技术的选择中应综合考虑[38]。当样品病毒含量接近最低检测限时，阳性检出的不确定性会非常大，同时也预示着样品来源场感染风险的极大不确定性。在出口贸易检疫监测中，针对此类风险，一是增加抽样监测的数量，二是需要重复多次开展检测。当前，基于PEDV免疫反应的不同血清学检测方法使用较为广泛，但每种检测方法都有其优缺点。因此，一套完整的测试方法有助于PEDV抗体的初步鉴定和高效、高通量的定量分析。Okda等[35]在iELISA、bELISA和FMIA之间观察到相似的Kappa值，表明这3种检测方法之间存在显著的一致性。Gimenez-Lirola等[39]研究发现，感染后基于全病毒的ELISA检测到的IgG抗体比IFA检测的时间长。检测PEDV抗体不仅能反映出抗体的分布和猪群的免疫水平，而且能反映未经免疫的猪群的感染史，因为抗体在猪体内的持续和存在时间要比PEDV病毒在猪体内排毒时间更长[2]。所以，PEDV的抗体检测试剂也可以用于对PEDV流行病学的回顾性研究。然而，PEDV毒株的进化是一个连续过程，目前已经发现了多个PEDV变异毒株。针对不同毒株单个抗原诱导产生的抗体，用任何一种抗体检测试剂进行检测，对其效率的评估是不可或缺的，但鲜有相关报道。故而在口岸入境监测检测中，不仅需要选择合适的检测方法和试剂，同时试剂的准确性、可靠性和有效性等验证参数，如分析敏感性(Analysis sensitivity,ASe)、分析特异性(Analysis specificity,ASp)、检测敏感性(Diagnosis sensitivity,DSe)、检测特异性(Diagnosis specificity,DSp)、参考样品的选择和数量等，也是必需要考虑的重要因素。

4 结语

美国猪病监测研究[17]显示，2019—2020年度美国猪群中的PEDV表观阳性率分布维持在1个较高的统计区间(P=0.035 0～0.253 0)，其分布值随生猪出栏数量、生长育肥阶段和各地区养殖状况不同而有较大差异。而且从监测研究中可以看出，PEDV感染对仔猪危害尤其大，死亡率超过50%，而成年猪感染后的死亡率较低。生猪移动以及猪肉制品的贸易交流是PEDV传播和扩散的主要方式。来自中国海关及有关口岸监测的数据显示，近些年来，中国与美国生猪以及猪肉贸易交流非常频繁且数量巨大，故而美国PEDV毒株通过生猪出口以及猪肉贸易交易传入我国的可能性很大，需要加强检测方法的研发、监测疫情并进行风险分析与评估。