胃饥饿素分泌调控机制的研究进展

2021-03-30 12:05杨文艳
动物营养学报 2021年1期
关键词:酰化酰基氨基酸

孙 睿 杨文艳*

(1.吉林农业大学动物科学技术学院,长春130118;2.吉林农业大学动物生产及产品质量安全教育部重点实验室,长春130118;3.吉林省动物营养与饲料科学重点实验室,长春130118)

胃饥饿素(Ghrelin),又称生长激素释放肽,是一种由28个氨基酸组成的多肽,由胃底黏膜泌酸腺X/A样细胞产生,约占胃黏膜细胞总数的20%[1]。作为一种多功能肽,Ghrelin广泛分布在下丘脑、垂体、肠道、肾脏、胰脏、胎盘等中枢和外周器官[2]。Ghrelin主要以2种形式存在:去酰基化Ghrelin(des-acyl-ghrelin,DAG)和酰基化Ghrelin(acyl-ghrelin,AG)[3]。Ghrelin作为生长激素促分泌素受体(growth hormone secretagogue receptor,GHSR)的内源性配体,除具有促进垂体释放生长激素(growth hormone,GH)的作用外[4],还是连接中枢神经系统和参与营养代谢的外周组织的重要方式[2],在促进摄食、改善胃肠功能、调节脂类代谢和能量平衡等方面也具有广泛作用。研究发现,Ghrelin与其受体GHSR-1a结合后,GHSR-1a会通过释放神经肽Y和影响下丘脑弓状核神经元的刺鼠相关蛋白来促使动物产生饥饿感,从而促进摄食[5]。不仅如此,通过向小鼠脑内注射Ghrelin,可促进脂肪细胞中与脂肪储存相关酶及蛋白的表达[6],且对脂质代谢存在外周效应,包括增加白色脂肪组织质量、刺激肝脏的脂肪生成等[7]。此外,Ghrelin对提高机体免疫力、改善内分泌功能、治疗心血管疾病等方面均具有重要作用[3,7-8]。Ghrelin的分泌是一个较为复杂的过程,包括mRNA转录、转录后的翻译、修饰、分泌及在体内的转运等,营养物质的摄入、体内激素水平等因素的变化都会影响到Ghrelin合成和释放的过程[9-10]。目前对于Ghrelin生理功能方面的研究与应用已较为成熟,但关于合成及其分泌过程的相关研究较少。因此,进一步探究Ghrelin合成和释放的机制及其影响因素,对改善动物健康、提高动物生产性能具有重要作用,对Ghrelin在动物生产中的应用也有着重要意义。

1 Ghrelin的合成、分泌及转运

1.1 Ghrelin基因的转录与翻译

从Ghrelin基因到Ghrelin肽的过程,需要在Ghrelin基因完成转录后,成熟的GhrelinmRNA翻译后生成Ghrelin前体蛋白原(Preproghrelin)[11]。人Ghrelin基因定位在3号染色体(3p25-26)上[12],研究表明,Ghrelin基因中有2个不同的转录起始位点,相对于ATG起始密码子来说,一个发生在-80位,另一个发生在-555位,会产生2个不同的mRNA转录本(转录本-A和转录本-B),其中转录本-A是胃中GhrelinmRNA的主要表现形式,而转录本-B上呈现的人类Ghrelin基因中存在1个短的非编码第一外显子[13]。对人和大鼠Ghrelin基因核心启动子序列的研究发现,其上游刺激因子(upstream stimulatory factor ,USF)可与Ghrelin启动子内多种具有活性的E-box序列结合,以调节Ghrelin基因的表达,当USF与Ghrelin启动子内同样具有活性的TATA-box序列结合时,USF还可以与RNA聚合酶的转录因子相互作用,间接证明了Ghrelin启动子活性可能通过调节某些重要的蛋白质-蛋白质间的相互作用来实现[14-15]。研究发现,Nkx2.2是一种包含对胰腺Ghrelin细胞分泌重要的转录因子的同源结构域,作为Ghrelin启动子的转录因子,具有增加人GhrelinmRNA表达的作用[16]。Ghrelin启动子中存在正调控区和负调控区,Shiimura等[17]研究表明,人Ghrelin启动子序列的-1 400和-1 800之间的核苷酸是抑制Ghrelin启动子活性的负调控区,而核因子-κB(NF-κB)可能是参与Ghrelin启动子活性负调控的一个重要的转录因子,上述这些转录因子都可能成为调控Ghrelin基因转录的重要靶点。

1.2 Ghrelin的加工与修饰

转录和翻译后的Preproghrelin由117个氨基酸组成,在结构上含有1个N-末端分泌信号肽,该信号肽会在内质网中被丝氨酸蛋白酶移除,成为由94个氨基酸组成的Ghrelin前体蛋白(Proghrelin)[18]。Ghrelin需要通过与GHSR-1a结合才能发挥其生理作用[19],为实现这一目的,Ghrelin需要将中链脂肪酸(通常是正辛酸)连接到其丝氨酸-3(Ser-3)上,这是一种独特的翻译后修饰的过程,即酰化,由Ghrelin O-酰基转移酶(Ghrelin O-acyltransferase,GOAT)在内质网中进行[20-21],此过程中需要辛酰基辅酶A(octanoyl-CoA)的参与,将丝氨酸辛酰化,使Proghrelin酰化为酰基化Ghrelin前体蛋白(Acly proghrelin)[22]。激素原转化酶1/3(prohormone convertase 1/3,PC1/3)将Acly proghrelin在单个精氨酸上进行有限的蛋白质水解加工后,形成含有28个氨基酸并具有生物学活性的Ghrelin。

GOAT是一种特异性催化O-酰基酸转移到Ghrelin的Ser-3羟基的酰基转移酶,也是具有多个跨膜结构域的膜结合酶,高度保守[23]。Lim等[24]研究了GOATmRNA在不同组织中的表达分布,发现GOATmRNA的表达情况与Ghrelin的分布是相对应的,但在敲除GOAT后,Ghrelin的酰化过程会被完全阻止,说明GOAT是Ghrelin酰化的关键酶。研究发现,应用体外GOAT活性测定的方法,对GOAT底物特异性进行研究,发现Proghrelin中Ser-3及周围的甘氨酸-1(Gly-1)和苯丙氨酸-4(Phe-4)是影响GOAT活性的关键氨基酸[25-26]。Darling等[27]在研究GOAT在Ghrelin中的结合位点时,通过Proghrelin和模拟Ghrelin的N-末端“GSSF”序列的短肽的突变,证实了Ghrelin的N-末端序列的重要性,并确定了Ghrelin结构中前4个氨基酸的侧链对GOAT起主要识别作用。因Ghrelin具有自分泌和旁分泌2种形式,所以GOAT除了酰化Ghrelin的自分泌作用外,对酰化Ghrelin的旁分泌及局部合成作用都可能发挥着重要作用[25,28]。

激素原转化酶(prohormone convertase,PC)家族作为一类蛋白水解酶,具有催化碱性氨基酸分裂的作用,常见的有PC1/3、PC2等[29]。Walia等[30]通过免疫组化试验证实了胃内Ghrelin免疫阳性细胞中PC1/3与Ghrelin共定位,而未见PC2的免疫染色现象。Seim等[31]研究发现,只有在缺失PC1/3的小鼠胃中才存在完整的Proghrelin,并证明了PC1/3是胃内Proghrelin转化为Ghrelin的关键转化酶,但在胰腺中却发现了Ghrelin免疫阳性细胞中PC1/3及PC2的共定位情况,一些数据也表明在胰腺中PC2同样在Proghrelin的加工与修饰中发挥重要作用,并且可能在局部释放Ghrelin机制中发挥作用,但具体机制尚不清楚[32]。

1.3 Ghrelin在体内的转运

研究发现,血液中DAG和AG的比例约为9∶1[33],Ghrelin在胃分泌颗粒细胞中形成后,经血液运输到靶器官发挥作用。但AG结构十分不稳定,会影响其跨室转运,特别是跨越血脑屏障[34]。因此,为确保Ghrelin可以顺利通过并充分发挥其作用,还需经过循环酯酶的快速脱酰基作用去除辛烷基,将AG转化为不活跃的去酰基化形式,即DAG[35]。在多种循环酯酶的检测中,丁酰胆碱酯酶(butyrylcholinesterase,BChE)是AG脱酰基的关键酶,主要由哺乳动物的肝脏合成并分泌,广泛存在于机体的大脑、肠、胃、脾脏、肾脏等部位[36]。研究表明,循环中的BChE可以在Ghrelin穿过血脑屏障之前将其水解变成DAG[37]。此外,有研究发现中枢BChE可以调节下丘脑局部产生的Ghrelin,并且对下丘脑各核团有直接影响[38]。最后在BChE作用下,DAG会顺利进入血液,通过血液循环被运送到相应的靶器官,再与这些部位原生质膜的GOAT会发生局部再酰化反应,使Ghrelin再次具有生物学活性,发挥其相应的生物学作用[21]。

2 营养物质对Ghrelin分泌的调控

动物在正常生理状态下,Ghrelin水平在摄食之前会有所升高,但在进食后会迅速下降,而食物中的营养物质是产生该作用的主要原因[39]。动物所摄入的葡萄糖、脂类、氨基酸以及微量元素等营养物质,都会影响到动物体内Ghrelin水平。

2.1 葡萄糖

葡萄糖是调节体内Ghrelin水平的重要因素之一。静脉注射或口服葡萄糖对胃内GhrelinmRNA表达及血浆中DAG的酰化都具有明显的抑制作用[40]。Sakata等[41]在体外培养的小鼠胃黏膜原代细胞中添加不同浓度的D-葡萄糖,发现D-葡萄糖浓度较高时Ghrelin释放量减少,但在D-葡萄糖浓度较低时Ghrelin释放量则明显增加。低糖诱导Ghrelin分泌可能与ATP敏感性K+(KATP)通道有关,研究发现在低葡萄糖浓度下,在MGN3-1细胞(一种Ghrelin分泌细胞)培养液中加入KATP通道抑制剂会抑制Ghrelin的分泌,并且,电压依赖性钙离子(Ca2+)通道也会参与这个过程[42]。在不同的葡萄糖环境中,调节葡萄糖应答的各种葡萄糖转运体、通道和酶都可能参与调节Ghrelin分泌,但它们在此过程中的确切作用仍有待研究[43-44]。

2.2 脂类

脂类物质对Ghrelin分泌的调控较为复杂,Ghrelin的酰化过程需要有脂肪酸的参与,从乙酸衍生到十四酸(C14∶0)的脂肪酸都可能会影响到Ghrelin的酰化过程,其中辛酸(C8∶0)是参与该反应的主要脂肪酸[45]。不同类型的脂肪酸对Ghrelin酰化的影响机制也不尽相同,研究发现摄取中链脂肪酸(MCFAs)或中链三酰甘油(MCTs)可增加胃内AG含量,并且修饰Ghrelin酰基的碳链长度与摄取MCFAs的碳链长度一致,表明摄入的MCFAs直接参与Ghrelin的酰基修饰过程[46]。此外,Lu等[47]通过向幽门结扎小鼠灌胃富含长链脂肪酸(LCFA)的脂质后,血清及胃中Ghrelin水平显著降低。在研究LCFA抑制Ghrelin分泌机制中发现,胃中产生Ghrelin的细胞表面存在大量的G蛋白偶联受体120(G protein coupled receptor 120,GPR120),作为调节体内外Ghrelin分泌的信号,同时GPR120也是LCFA的受体,所以与进食相关的LCFA增加会与Ghrelin细胞上的GPR120相互作用,从而抑制Ghrelin的分泌[48-49]。

2.3 氨基酸

研究发现,一定水平的循环氨基酸会影响体内Ghrelin的分泌[50]。不同的氨基酸对Ghrelin的影响也有所不同。Fukumori等[51]将蛋氨酸及生理盐水混合液连续注入泌乳奶牛的颈静脉,发现血浆中增加的蛋氨酸水平促进了Ghrelin的分泌。此外,胃肠内分泌细胞上的味觉感受器会感知营养物质,并控制激素信号的传递[52]。Vancleef等[53]研究发现,一些功能性氨基酸会通过其特定种类的氨基酸味觉受体,刺激MGN3-1细胞中Ghrelin的分泌,例如L-苯丙氨酸可通过钙敏感受体(CaSR)感知Ghrelin,谷氨酸钠通过味觉受体1型成员1(TAS1R1)和味觉受体1型成员3(TAS1R3)感知Ghrelin等,但由于体内环境复杂,这些局部营养感知机制在体内可能会被间接抑制Ghrelin释放的机制所推翻,其中可能涉及胰岛素或其他信号,还有待进一步研究。

2.4 微量元素

铜、锌作为具有促生长作用的微量元素,对动物体内Ghrelin水平以及合成过程均存在一定影响。Zhang等[54]发现,在断奶仔猪饲粮中添加四碱式氯化锌可提高其血浆Ghrelin水平,并促进垂体GH的分泌,进而促进生长。但这种促生长作用可能与采食量无关,Yin等[55]研究表明,氧化锌可刺激胃黏膜细胞产生Ghrelin,但不影响GhrelinmRNA表达水平,其原因可能是氧化锌在转录后水平上刺激了胃中Ghrelin分泌。G蛋白偶联受体39(GPR39),也是Ghrelin受体家族的成员之一[56]。锌离子(Zn2+)作为一种激动剂,可通过刺激磷脂酶C(PLC)活性和生成环磷酸腺苷(cAMP),从而激活GPR39[57],这可能是Zn2+提高机体内Ghrelin水平的方式之一,但需要进一步的试验来证明这一点。

在铜对机体Ghrelin分泌调节方面,Yang等[58]研究发现,在生长猪饲粮中添加铜可以促进生长猪胃底腺的颈部和基底部Ghrelin免疫阳性细胞的发育,并能促进GhrelinmRNA的表达。黄元龙[59]研究表明,在绵羊饲粮中添加硫酸铜可提高其皱胃中GhrelinmRNA及蛋白表达,但具体的作用途径和机制尚未阐明。核转录因子激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)是Ghrelin上游调控因子的结合位点之一[58]。有研究指出,添加低浓度铜可提高AP-1的结合能力[60],其主要机制为铜会诱导c-Jun N-末端激酶/应激激活蛋白激酶和p38通路磷酸化和活化水平增加,从而激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)途径,最终激活转录[61],这可能是铜调节Ghrelin转录的方式之一。

3 激素对Ghrelin分泌的调控

3.1 生长抑素(somatostatin,SS)

SS是胃黏膜中产生的一种多肽,它会以旁分泌的方式抑制Ghrelin的分泌[62]。胃中产生Ghrelin的细胞是封闭型内分泌细胞,与管腔之间没有连续性,并且与胃中产生SS的分泌细胞直接接触,若SS分泌水平升高,则会影响Ghrelin的释放过程[63]。Fukuhara等[64]研究发现,静脉注射SS可降低大鼠血浆中Ghrelin水平,并且对其抑制作用具有剂量和时间的依赖性。Silva等[65]对SS的2种类似物SOM230和奥曲肽进行研究,发现2种物质均对禁食小鼠体内AG的分泌产生了明显的抑制作用,其中奥曲肽对其抑制作用更强。SS受体可能是影响Ghrelin分泌时发挥作用的关键[66]。不仅如此,杜改梅等[67]通过分析断奶前后小鼠胃中GOAT基因的表达规律,提出在胃中SS可能会通过抑制GOAT的表达调控胃酸的分泌,但该试验中并未证实是否是通过调节Ghrelin从而影响到胃酸的分泌。Gahete等[68]通过在培养的小鼠脾细胞中对SS进行基因敲除,发现GOAT的mRNA表达量明显升高,证明了SS对GOAT的表达存在一定的抑制作用,这也是SS调节Ghrelin分泌的途径之一。

3.2 瘦素

在结构上,产生瘦素的细胞主要位于胃黏膜的底部,大量的Ghrelin细胞被其紧密包围,故瘦素会以与SS类似的方式在结构上抑制Ghrelin的旁分泌[69]。在体内,空腹状态下血浆中Ghrelin水平与瘦素水平呈负相关趋势[70]。Zhao等[71]试验表明,瘦素会以剂量依赖性的方式直接抑制大鼠胃GhrelinmRNA的表达,并证明了禁食状态下胃GhrelinmRNA表达水平的升高,部分原因是通过降低胃瘦素水平来实现。同时瘦素作为长期调节能量平衡、抑制食物摄入并导致体重减轻的介质,在中枢性食欲控制中与Ghrelin的调节是反向的[72]。Nour等[73]研究表明,瘦素可通过磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)-磷酸二酯酶3(PDE3)途径抑制Ghrelin的分泌,并且这种相互作用可能在调节摄食中发挥重要作用。

3.3 胰岛素

在机体正常情况下,注射胰岛素后血浆中Ghrelin水平会降低,其原因可能是果糖会提高机体Ghrelin水平,而胰岛素会以激素活性的形式抵抗和影响果糖的摄取能力,以减少酰基Ghrelin水平[74-75]。正常人注射胰岛素后,与胰岛素抵抗个体相比,胰岛素敏感个体的总Ghrelin水平以及AG水平均显著降低,表明Ghrelin的修饰过程可能受到胰岛素敏感性的影响[76]。Seim等[11]从睾丸和LNCaP前列腺癌细胞系中克隆得到与人类Ghrelin基因内含子2中的隐含外显子相对应的胰岛素应答转录因子,命名为in2c-ghrelin,添加胰岛素会显著增加in2c-ghrelin的表达量,该转录因子同时可编码Ghrelin,表明胰岛素可能通过调节Ghrelin的转录因子参与Ghrelin的合成过程。Song等[77]发现,与哺乳动物相比,通过皮下注射胰岛素的方法可增加鸡腺胃中Ghrelin的表达,胰岛素在增加外周Ghrelin的表达时,会下调下丘脑Ghrelin和GHSR-1a的表达水平,从而抑制了中枢Ghrelin/GHSR-1a系统的激活,其机制可能与PI3K途径有关[78]。

3.4 胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)

GLP-1具有促进胰岛素分泌、调节动物摄食的作用[79]。研究表明,进食会促进GLP-1的分泌,向体内注射天然的GLP-1,可明显抑制进食一段时间后血浆Ghrelin水平升高的情况,并且通过对血浆中葡萄糖、胰岛素、GLP-1和Ghrelin水平的测定,发现血浆中Ghrelin水平与胰岛素水平呈负相关,说明GLP-1对Ghrelin的抑制作用可能是通过促进胰岛素的分泌间接实现[80]。胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)在外周和中枢神经系统中均有表达,研究发现GLP-1对Ghrelin的抑制作用与其受体活性有关[81]。Hong等[82]通过向由饮食诱导的肥胖小鼠脑内注射Exendin-4(EX-4,一种GLP-1激动剂),发现小鼠的下丘脑、胃和血浆中Ghrelin均被抑制,但下丘脑和胃中的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号活性显著增强,当mTORC1信号转导的机制靶点被阻断时,GLP-1和EX-4的作用显著减弱,证实mTORC1是GLP-1R被激活后诱导Ghrelin下调的关键信号通路。

4 影响Ghrelin分泌的其他因素

除上述因素外,神经系统调节也是动物机体对于体内Ghrelin水平调节的重要方式。研究人员证实,切除迷走神经后,可使动物因禁食而引起的Ghrelin水平升高消失,并短时间降低体内Ghrelin水平[83]。Mundinger等[84]通过电刺激激活肠交感神经,发现可显著提高大鼠门静脉Ghrelin水平,证明交感神经也可直接刺激Ghrelin分泌,去甲肾上腺素(noradrenaline,NE)可能起到关键作用。Zhao等[85]研究发现,在Ghrelin分泌细胞培养基中添加NE可刺激Ghrelin的分泌,但通过利血平降低小鼠交感神经元肾上腺素能神经递质后,小鼠因禁食引起的Ghrelin水平升高被阻断。Mani等[86]研究表明,NE会通过释放细胞内Ca2+来实现,在这过程中,cAMP及其下游鸟苷酸交换蛋白(EPAC)的激活,也起到重要作用。

5 小 结

尽管目前对于Ghrelin生理作用的研究有了一定进展,但对调节Ghrelin合成及分泌的分子机制的认识还相对滞后,对于Ghrelin分泌整体过程的系统性研究也相对较少,很多问题还缺乏一致性的结论。Ghrelin合成和分泌的进一步探究,可为更精确地调控Ghrelin的表达、实现Ghrelin的功能奠定基础,也为阐明动物的促生长机制提供理论依据。

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