长寿地区73例结节性甲状腺肿患者MTHFR基因C677T和A1298C多态性研究*

沈良贤，范原铭，李 泉，陈祖翼，邱孝兰，周学刚，陶 凤△

重庆市长寿区人民医院：1.科教科；2.普外二科；3.检验科，重庆 401220；4.遵义医科大学附属医院检验科，贵州遵义 563000；5.重庆市长寿区人民医院超声科，重庆 401220

结节性甲状腺肿(NG)是单纯性甲状腺肿的后期表现形式。据报道，NG的发病率为6%～7%，且病史较长的NG可发生癌变[1-2]。有研究表明，瑞典长期实施的补碘计划并没有影响缺碘或碘丰富地区甲状腺肿及甲状腺癌的发生趋势[3]。因而除碘外，仍有其他多种因素参与NG的发生与发展。亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是叶酸和同型半胱氨酸代谢的一个关键酶。目前研究最多，且与疾病关系密切的MTHFR基因单核苷酸突变位点为C677T和A1298C，可导致热不稳定性和(或)酶活性降低[4]。相关研究认为，这个基因的遗传变异会影响DNA合成、修复及甲基化过程，从而影响甲状腺癌及自身免疫性甲状腺疾病(AITD)的易感性[5-7]。然而，MTHFR基因多态性与NG的相关研究鲜见报道，为此本研究旨在寻找MTHFR C677T和A1298C基因多态性与NG的相关性，为NG的预防及治疗提供理论依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集重庆市长寿区人民医院2018年8月至2019年11月经术后病理确证的甲状腺功能正常的NG患者73例作为病例组。另选取经高清晰超声检查甲状腺组织正常及甲状腺功能正常的76例体检健康者作为对照组。纳入标准：根据2015年最新出版的美国甲状腺协会关于甲状腺结节和分化型甲状腺癌的管理指南进行病理诊断。排除标准：(1)代谢性疾病(高血压、糖尿病、血脂异常)；(2)甲状腺疾病(甲状腺炎、甲状腺良恶性肿瘤)；(3)其他恶性肿瘤；(4)精神障碍。本研究符合人体试验伦理学标准，并得到重庆市长寿区人民医院伦理委员会的批准及患者知情同意。

1.2仪器与试剂 Hema3200PCR扩增仪、HemaTGL-16R冷冻离心机购自珠海黑马公司；一次性乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)真空抗凝管；血液基因组DNA抽提试剂盒升级款和PCR扩增试剂购自上海生工生物工程股份有限公司。

1.3方法

1.3.1基因组DNA提取 抽取外周静脉血2 mL，EDTA-Na2抗凝，-80 ℃保存待用。采用Ezup柱式血液基因组DNA抽提试剂盒升级款提取DNA。

1.3.2引物设计及合成 引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，rs1801133上游引物5′-AACAATGTTTAATCCGGTGCC-3′，下游引物5′-ATCCTTTGGGATCTTT-3′；rs1801131上游引物5′-CACTCCAGCATCACTCACTTTG-3′，下游引物5′-AAGAAGTTTGCATGCTTGTGG-3′。

1.3.3PCR扩增 反应体系25.0 μL，ddH2O 18.3 μL、10.0×缓冲液(含MgCl2)2.5 μL、dNTP (10 mmol/L)1.0 μL、模板DNA 1.0 μL、Taq酶0.2 μL、Primer mix 2.0 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min，然后按94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循环38次，末次循环后72 ℃延伸10 min。

1.3.4基因测序 PCR产物送上海生工生物工程股份有限公司，利用一代Sanger测序的方法，对PCR产物进行测序。

1.3.5基因型分析 通过sequence analysis软件对序列质量进行初步分析，并通过DNAMAN6.0.3.99软件与GenBank(MTHFR NG_013351)的基因序列进行比较。

2 结 果

2.1两组年龄、性别情况比较 病例组中，男11例，女62例；年龄21～80岁，平均(51.37±10.92)岁，其中年龄>30岁的占96.05%，>60岁的占23.68%。对照组中，男40例，女36例；年龄17～92岁，平均(52.29±16.46)岁，其中年龄>30岁的占97.56%，>60岁的占19.51%。病例组与对照组年龄、性别比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2两组男女基因型分布比较 病例组、对照组及NG组+对照组基因型C677T、A1298C男女分布比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组男女基因型分布比较(n)

2.3MTHFR C677T和A1298C基因型或等位基因的分布情况 两组MTHFR C677T和A1298C基因型频数均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。病例组A1298C多态性CC基因型频数及C等位基因频数与对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。病例组和对照组C677T多态性比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 MTHFR C677T和A1298C基因型或等位基因的分布情况[n(%)]

3 讨 论

MTHFR位于第1号染色体1p36.22，全长27.374 kb，共有外显子12个，其编码656个氨基酸残基组成的蛋白，负责催化5,10-亚甲基四氢叶酸不可逆地还原为5-甲基四氢叶酸。自2003年人类基因组计划发现MTHFR以来，在世界范围内已发表许多关于MTHFR的分子和流行病学研究，但其与甲状腺功能不全之间的关系的相关研究较少，且结果存在争议。

甲状腺激素是酪氨酸碘化物，当MTHFR基因突变时，MTHFR酶活性降低，可通过影响酪氨酸合成，从而影响甲状腺激素的合成；其还可通过影响甲状腺互向三碘甲状腺原氨酸的转化，导致甲状腺功能减退。促甲状腺激素(TSH)是主要的有丝分裂因子，任何使TSH水平升高的物质都会刺激结节的形成[8]，提示MTHFR基因多态性有可能是NG形成的原因之一。ARAKAWA等[5]研究表明，在日本人群中未发现C677T或A1298C多态性与导致甲状腺功能减退或亢进的AITD相关；且C677T和A1298C的基因型和等位基因频率也不影响AITD的预后。ABU-HASSAN等[7]研究发现，约旦女性人群C677T多态性与甲状腺功能减退或亢进的AITD无关，而A1298C多态性可能是影响甲状腺功能减退或亢进的AITD发生的因素，且CC、TA和TC单倍型可能是甲状腺功能减退发生的影响因素。CHEN等[6]的荟萃分析显示，MTHFR C677T多态性与甲状腺疾病之间没有相关性，MTHFR C677T纯合子TT基因型多态性与白种人和亚洲人的甲状腺癌发生风险明显相关。而本研究发现C677T多态性与NG没有相关性，提示C677T多态性与甲状腺癌相关，而与NG可能没有相关性。本研究结果显示，A1298C基因多态性可降低NG发生的风险，与ABU-HASSAN等[7]和ARAKAWA等[5]的结果相反。上述研究中的研究对象是自身免疫性甲状腺疾病患者，因此，导致结果不一致的原因可能跟种族、地理及纳入、排除标准等因素的不同有关[9]，而本研究中的NG是不伴有甲状腺功能异常的非毒性甲状腺肿的后期表现形式，可能与甲状腺激素水平降低，TSH水平反馈性升高及TSH长期慢性刺激甲状腺组织有关[2]，表明MTHFR基因A1298C位点多态性可能通过影响甲状腺激素的合成、转化来降低NG发生的风险。

本研究中NG患者年龄>30岁的占96.05%，>60岁的占23.68%，全国自1996年开始普遍实行食盐碘化，说明大部分患者可能在中青年时期缺碘，甲状腺已发生病理改变或已经有结节形成，在食盐碘化后NG可能仍旧在发生，或并未得到治疗，或也没有向恶性发展。因此，除碘外，还可能有其他因素影响NG的发生、发展。也有研究表明，补碘后结节性甲状腺肿DNA指数、异倍体率、增殖指数均明显增高[10]。而MTHFR除了可以影响甲状腺激素的合成及转化外，还可以为体内嘌呤、嘧啶的合成及DNA甲基化提供甲基，从而影响DNA的合成、修复及DNA甲基化，而甲基化和DNA合成在癌症的发展中起着至关重要的作用[11]。本研究发现，MTHFR基因A1298C位点多态性与对照组比较差异有统计学意义，表明A1298C位点多态性对NG可能是一种保护因子。

本研究对照组中C677T的T等位基因频率、A1298C的等位基因频率(分别为36.18%、23.03%)与YANG等[9]报道的中国人群的等位基因频率(分别为36.9%、22.4%)接近，说明对照组选择无偏差。病例组、对照组及病例组+对照组C677T、A1298C基因型男女分布比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，这与李丹丹等[12]、VIDUDALA等[13]报道的变异频率没有性别特异性的结果一致。

本研究的局限性在于：(1)样本量相对较小，单核苷酸多态性位点少且只选择了两个单核苷酸多态性位点进行分析；(2)环境风险因素的缺乏限制了基因与环境相互作用的分析；(3)排除标准中，除了通过甲状腺超声影像检查及血清学检测甲状腺功能外，仅依靠其既往病史、空腹血糖排除代谢性疾病。在今后的研究中还应扩大样本量，评估基因、基因环境和同一基因中不同单核苷酸多态性位点之间的相互作用，执行更严格的纳入、排除标准，将MTHFR多态性纳入易感个体的筛选和检查。

综上所述，MTHFR基因A1298C位点单核苷酸多态性可能通过影响甲状腺激素的合成转化及DNA甲基化、合成修复等影响NG发生风险，而C677T位点单核苷酸多态性与NG的发生无相关性。