植物类型Ⅲ聚酮合酶基因工程的研究进展 *

罗在柒 陆 俊 田 凡 颜凤霞 黄安香

(贵州省林业科学研究院 ，贵州 贵阳 550005)

随着人们对生活质量的不断追求，以及对中药活性成分研究的不断深入，许多天然活性成分的实际应用需求不断增加。然而，受药用植物资源的贫乏和中药活性成分含量偏低的限制，常规的种植方法已难以实现高质量植物次生代谢产物的需求。现代生物技术能够从分子水平实现对中草药有效成分合成代谢的人工调控，并且可以借助转基因工程技术实现基因的异源表达，从而提高有效药用成分的产量和质量，其中聚酮类化合物研究得比较系统和深入，现已开辟了一条药用资源开发利用的新路径[1]。

1 聚酮化合物与聚酮合酶

聚酮合酶(polyketide synthase，PKS)是调控植物产生次生代谢产物为聚酮类化合物酶的复合体，药用方面具重要工业价值，目前上市的医药用或农用抗生素药物化学结构中，聚酮类化合物的位于各类天然产物前列，通常常见的聚酮类抗生素有红霉素(erythromycin)、两性霉素(amphotericin)、螺旋霉素(spiramycin)、四环素类(tetracycline)等[2]。因为聚酮化合物结构的多样性导致了代谢过程中产生多样性的活性，行使多种重要生物学功能活性。

1.1 聚酮合酶的类型划分

岂止目前，通常将PKS分为3类，PKSI型也称为模块类，由多个催化结构域通过共价连接后形成模块，再由多个模块组成多功能酶的复合体，这类物质主要合成大环内酯类抗生素，如红霉素、利福霉素、西罗莫司等；PKSII型也称为重复型、叠代或芳香类，含有的各个催化结构域为独立的蛋白，具有2个不同的酮类酶连接缩合后形成的酮缩合酶，如KSα和KSβ，其中的KSα与PKS I中的KS功能相似，而KSβ控制的是聚酮链的长度。通常PKS II型酶主要控制合成芳香族的物质，譬如蒽环类及四环化合物等； PKSⅢ型又称查儿酮型PKS，和其他两种PKS不同， PKS Ⅲ型直接作用于酰基CoA活化的简单羧酸，然而，Ⅰ型和Ⅱ型PKS是通过ACP活化酰基-CoA的底物[3]。

1.2 植物类型Ⅲ聚酮化合物合酶超家族产物多样性及催化原理

植物Ⅲ型PKS，由40-45 kD的二聚体多肽组成，编码基因通常由2个外显子和1个内含子，在所发现的Ⅲ型PKSs中完全相同，可完成重复缩合反应，其具有高度保守的催化活性中心，即Cys-His-Asn的组合结构，被命名为查尔酮合酶(chalcone synthse，CHS)。这类酶主要出现在植物界的植物体代谢，但在枯草芽孢杆菌、链霉菌和米曲霉等少数细菌及真菌中也存在[4]。

目前，中药黄酮类化合物有效成分的合成路径已经很明晰[5]。在已发现的4000余种的黄酮类化合物种，主要有黄酮(flavones)、异黄酮(isoflavones)、黄酮醇(flavonols)花色素苷(anthocyanins)等类别。植物次生代谢基因工程方面已有近 30 种不同功能的植物PKSs 基因碱基序列被相继挖掘和功能验证。其中包括了：芪合酶(Stilbene synthase, STS)、CHS、2-吡喃酮合酶(2-Pyrone Synthase,2-PS)、苯亚甲基丙酮合酶、吖啶酮合酶(Acridone synthase,ACS、戊烯酮-色酮合酶(Pentaketide chromone synthase, PCS)、4-香豆酰甘油酸合酶(p-Coumaroyl triacetic acid synthase,CTAS)、辛烯酮合酶(Octaketides synthase, OKS)、联苄合酶(Bibenzyl synthase,BBS)、二苯甲酮合酶(Benzophenone synthase,BPS)、联苯合酶(Biphenyl synthase,BIS)、芪-羧酸酯合酶(Stilbenecarboxylate synthase,STCS)、芦荟松合酶(Aloesone synthase,ALS)、苯戊酮合酶(Valerophenone synthase,VPS)、姜黄素合酶(Curcuminoid synthase, CUS；Curcumin synthase 1-3, CURS1-3)等，大量研究证明：植物类型Ⅲ聚酮化合物合酶(PKS) 决定该类化合物基本分子骨架建成和代谢途径碳硫走向，在该类化合物生物合成起始反应中起着关键作用，是合成途径的关键酶和限速酶。

目前，已经成功分离得到 14 种植物类别的PKS Ⅲ型基因，像虎杖(PolygonumcuspidatumSieb. et Zucc[6-7])、小立碗藓(Physcomitrellapatens)、金鱼草(AntirrhinummajusCHS AMCHS)、八仙花(Hydrangeamacrophyllavar.thunbergii)、紫花苜蓿(MedicagosativaCHS)、掌叶大黄(RheumpalmatumBAS)、花生(ArachishypogaeaSTS)和野葛(PuerarialobataCHScDNA)等，这些基因都既具有保守性和独特的个性这些同祖同源基因及其表达产物既有共性也表现出许多独特个性，这些个性赋予此类次生代谢产物结构上的多样性[10]。其中，虎杖根中分离得到的PcPKS 5表现出高效率的催化效率[8-9]，并成功遗传转化到壶瓶枣表现出较好的抗真菌能力[11-12]。以上超家族内其他成员酶(CHS-Like) 功能的多样性均来自其原型酶-CHS 活性位点的小的修饰影响了该类酶活性中心空间构象，空间变化极大改变了酶分子的起始底物选择性、链延伸长度和环化反应机制[13-14]。

为更多了解功能酶活性差异可能产生的机制，以确定其高效 BAS 活性的分子机理，开展了酶蛋白的三维结构比较。蛋白晶体学研究以PKSs 家族不同成员的功能多样性来自于酶催化位点的非常微小的构象变化[15]。类式的Austin和Noel研究认为紫花苜蓿“门卫”Phe215 和 Phe265是调节PKSⅢ类型 活性位点与辅酶 A(Co A)结合通道之间的空间结构的关键位点[16]。掌叶大黄 的相关研究得到了一个显著特点是 Phe215(Ms CHS2 顺序)被 Leu 取代，而取代对于该酶的 BAS 功能活性具有自身的独特性。试验得到Rp BAS 的Phe265(Ms CHS2 顺序)与 CHS2 的区别是其侧链构象更加靠近 Leu215 ，并形成相互疏水作用，这两个氨基酸基团构象变化致使 BAS 活性扩大两倍，且还限定了其底物专一性[17]。相类似的Pc PKS1 是一个同时拥有 CHS 和 BAS 活性的双功能酶，且 Pc PKS1 的 BAS催化活性效率(Kcat/Km) 是 Pc PKS2 的70 倍[7]。然而，在 Pc PKS1 序列中，Phe215 和 Phe265也存在保守性，我们也推测出Pc PKS1区别于Pc PKS2特异的重要氨基酸序列，是决定 BAS 活性的关键位点。以上研究再次证明了以查尔酮合酶为原型酶的植物类型Ⅲ PKS 超家族是研究系统进化和蛋白结构与功能关系的模式分子家族。

1.3 PKS功能与机制多样性

植物聚酮类化合物(Polyketide)主要包含酚类、芪类及类黄酮化合物等三大类物质，这些物质在调控植物花色、防止紫外线伤害、预防病原菌及昆虫危害，以及作为植物与环境互作信号分子方面扮演重要的生物学功能，况且这类化合物具有丰富多样的生物学活性，在人体保健及疾病防控方面被广泛应用[18]。

植物类型Ⅲ PKS 超家族其他成员酶(CHS-Like) 功能的多样性来自原型酶——CHS 活性位点的小的修饰，这样极小的变动改变了起始底物的选择性、链延伸的长度和环化反应机制。因此，揭示植物类型Ⅲ PKS超家族结构与功能间的关联作用，对于利用该类酶进行基因工程、代谢工程遗传操作是必不可缺的重要资源[19]。

2 存在问题与展望

有关聚酮合酶基因的最新研究表明，药用植物具有聚酮合酶基因，并实现了异源表达[20]。一些聚酮合酶参与螺莱素的生物合成[21]，烟草植物中也相继克隆得到查尔酮合酶基因[22]，近期研究从树莓中获得具有查尔酮和苯亚酮合酶的双功能聚酮合酶基因[23]。另外，在姜科、非洲菊、余甘子等植物聚酮合酶基因研究也取得明显进展[24-26]，相关酶基因在肠道菌群中产生活性毒素具有抑制直肠癌等疾病的防控[27]。因此，植物III型聚酮合成酶(PKSs)产生多种次生代谢物，呈现一个基因的复制和功能的复杂性，植物与微生物系统PKS研究也得到深入[28]。在一些传统中草药内生真菌中也鉴定出Ⅲ型聚酮合成酶基因[29],一种Ⅲ型聚酮合酶可以催化螺旋藻毒素的生物合成[30]，成功表达了一种用于改进异源代码的自动化数据驱动管道酶基因，目前该类基因挖掘势头呈平稳态势在发展[31]。

相关植物聚酮合酶的研究显示，在分离和克隆CHS 基因的近30 年中，已经报道了200多个基因。目前，药物来源于聚酮化合物的每年销售额已超过 100 亿美元。然而，仍然存在许多药用植物中的聚酮类化合物PKS基因始终没有得到分离和克隆，基于PKS功能与机制多样性，有其在苯亚甲基丙酮的生物合成究竟由BAS或者CHS/BAS，或其它类型酶等的路径选择等诸多问题仍然未知。

综上所述，今后需大量开展聚酮合酶基因的克隆以及蛋白酶的生物学活性的研究，不但可以补充聚酮合酶超家族基因的成员，还有助于深入认识植物聚酮化合物药用成分合成的分子机理。同时，对植物Ⅲ型聚酮合酶及整个超基因家族的深入研究为寻找新型药物，以及对提升植物本身药用成分和促进作物的遗传改良等提供新的途径，以及对基因工程获取聚酮化合物开发新药具有重要的科学和现实意义。