脊髓损伤对血-脊髓屏障水代谢机制的影响

郭铁峰 邓强 杜凯然 柳树英 张彦军 杨志华 李中锋 杨镇源 彭冉东 李军杰 徐浩军

(1甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050；2甘肃中医药大学)

脊髓损伤(SCI)是脊柱外科常见的严重疾病之一,属中医学外伤瘀血所致“腰痛”“痿证”“癃闭”等范畴，常伴随损伤节断以下肢体功能障碍，是国内外脊柱外科领域亟待解决的重大医学问题之一。继发性SCI(SSCI)为伤后几小时至几天发生的一系列激活的自身破坏过程，所产生的脊髓损害并不亚于原发损伤，对继发性损伤的预防及治疗，往往决定了后期脊髓神经再生及功能的恢复与重建，而“血-脊髓屏障”(BSCB)损害所引起的水肿、椎管内压力增高，组织灌注降低则是继发性损伤中最主要的病理过程，所以在SSCI早期保护BSCB功能、逆转脊髓水肿对SCI预后具有重要的意义。随着该病诊疗发展的需要，SSCI防治的相关研究仍存在亟待解决的关键问题：①目前研究尚不能完全阐述SSCI中BSCB功能异常的分子生物学机制，以致在该病治疗方面缺乏明确的理论基础与科学依据；②激素冲击疗法作为SSCI主要治疗手段之一，但常引起一过性高血压、高血糖、心动过速、电解质紊乱、严重感染、甚至死亡等严重并发症，临床应用具有一定局限性。因此，研究并阐明SSCI中BBSC功能异常的相关基因调控机制，并寻找一种有效、快速且不良反应低的治疗方法一直是脊柱外科领域的研究热点之一。本文就SCI对BSCB水代谢机制影响研究进行综述。

1 SSCI中BSCB水代谢异常机理

SCI通常与BSCB破坏具有直接关系，导致血管源性脊髓水肿，主要是细胞外空间过量的水积累〔1〕。SCI分为原发性SCI和SSCI。其中，SSCI 产生的一系列继发性损害，大多由于损伤节段缺血缺氧，BSCB连续毛细血管内皮炎性改变，通透性增加等原因所引起，包括水肿、炎性反应、局部缺血-再灌注损伤、Ca2+溢出及过氧化基团等，这些异常变化会进一步加重原发病灶周围神经组织的破坏性病变，导致神经功能损害持续发展并加重，其对脊髓的破坏远远超过了原发性损伤，继发性损害的程度直接决定该病预后。继发性损害的病理改变主要是以血管源性水肿与细胞毒性水肿为基础发展而来。在急性损伤发生后，BSCB中连续性毛细血管内皮损坏，内皮细胞间隙增宽，血管壁连接松散〔2〕，多糖-蛋白质复合物所带的负电荷短暂消失，血管外炎症因子、血浆蛋白逐渐进入脊髓实质聚集，引起水肿并加重炎性改变〔3〕。另一方面，创伤所致脊髓微循环障碍，使损伤节段缺血缺氧不断加重，导致星形胶质细胞营养供给受到抑制，腺苷三磷酸(ATP)合成减少，细胞离子转运受到抑制，细胞内渗透压异常改变，大量组织液进入神经细胞内，细胞肿大，即出现细胞毒性水肿，水肿导致细胞外间隙变狭窄，在电解质异常的同时，进一步压迫神经组织，白质水肿及低灌注将促进继发组织坏死，此外，水肿致脊髓内压增高，加重髓内微循环障碍，使组织因缺氧、缺血致液化坏死。所以，创伤后若不及时逆转脊髓水肿，则有可能形成水肿-缺血的恶性循环，而 BSCB 对水调节功能的异常改变正是导致这一系列病理连锁反应的根本机制。

2 水通道蛋白(AQPs)在SCI中的表达

AQPs，又称水孔蛋白，是细胞膜上内在膜蛋白，属于膜通道家族中的一类蛋白，是参与水分子跨膜运输的重要通道〔4〕。SCI发生后，AQP-1在星形胶质细胞、神经元纤维、室管膜细胞表达迅速增加，持续表达上调可持续11个月，AQP-1长时间持续表达上调不仅会导致神经元及轴突水肿而发生肿胀，而且会导致星形胶质细胞向损伤区域移动变相促使瘢痕组织形成〔5〕。国外有研究显示，SCI后细胞中的AQP-9表达上调后可减少SCI对AQP-9的诱导，侧面减少脊髓水肿，减少神经元凋亡〔6〕。据研究发现有3个AQPs在中枢神经系统(CNS)内表达较高，其中AQP-4隶属于水通道家族，大量分布在脑-脊髓屏障的星形胶质细胞之中，主要作用是水分子快速跨膜转运，在中枢神经组织水分调节代谢方面发挥出至关重要的作用〔2〕。随着对其研究的深入发现，SCI造成星形胶质细胞膜上AQP-4的表达变化，是导致脊髓水肿及神经细胞毒性水肿重要生物学机制之一。由此可见SCI后，AQP-4与SCI的病理机制密切相关，其最为重要的表达在星形胶质细胞、神经元、室管膜细胞及内皮细胞〔7〕，在SCI整个病理机制的发展过程中起到重要作用。

3 BSCB调控水代谢的分子生物学机制

3.1AQP-4在SSCI中的表达 研究证实 SSCI 中 BSCB 损伤所致连续毛细血管内皮及星形胶质细胞胞膜上AQP-4的表达变化，是发生血管源性水肿、细胞毒性水肿的主要分子生物学机制之一。AQP-4 由美国科学家在1988年研究人类红细胞时发现〔8〕。其作为调控水分子平衡的重要信号蛋白在 SSCI 脊髓水肿的形成和消退中起重要作用〔9〕。BSCB 与“血-脑屏障”相似，基本结构包括毛细血管内皮细胞及其间的紧密连接(TJ)、基膜、周细胞和星形胶质细胞终足。AQP-4 主要在星形胶质细胞上表达，分布于包绕血管周围的星形胶质细胞足突上，当发生脊髓损伤时，其在与血管直接接触的足突上呈极性分布，同时其也沿着神经纤维网的突起广泛分布，参与形成与脑脊液接触的软脑膜和室管膜表面屏障〔10〕，AQP-4 的极性分布主要是指其在毛细血管、蛛网膜和软脑膜等与星形胶质细胞及其终足直接接触的部位上具有高表达、高活性的特点，说明 AQP-4 作为胶质细胞与脑脊液和血管间的水调节与转运的重要结构基础。其在维持中枢神经系统水平衡中起了至关重要的作用〔11〕。研究认为〔12〕，AQP 参与中枢神经系统水肿的发生发展过程，在缺血再灌注损伤皮层区域的 AQP-4 表达增加，说明 AQP-4 在缺血导致的脑水肿中起重要作用，而在小鼠脑缺血模型中，AQP-4 敲除可使细胞毒性脑水肿减轻且神经功能得到改善。 Li等〔13〕证实脑水肿的减轻伴随着 AQP-4 表达下降，AQP-4 的表达与脊髓水肿呈正相关。在脊髓损伤后的急性水肿过程中，AQP-4 表达迅速升高〔14〕，损伤后1 d，出现血管源性水肿，AQP-4及其 mRNA 表达开始增加，3 d达高峰并出现细胞毒性水肿〔15〕。此外，钠钾泵作用于 AQP-4的K27和W30位点，病理状态下钠钾泵的失调对 AQP-4的水通透性产生影响，说明 AQP-4 参与了从血管源性水肿到细胞毒性水肿的整个病理过程。虽然目前已经证实 AQP-4 与脊髓损伤后的水、离子失衡的相关性及重要性。但AQP-4作为 BSCB 水代谢的重要调控蛋白，对其调控机制却知之甚少，所以明确调节AQP-4表达变化的分子机制将为 SSCI 脊髓水肿的治疗提供新的思路与靶点。

目前，研究表明 AQP-4 存在多种蛋白的调控位点，其中 Ser180 和 Ser111 是参与AQP-4动态调节的主要位点，作用于该位点的蛋白包括磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)〔16〕、蛋白激酶(PK)C〔17〕、钙/钙调素依赖蛋白激酶(CaMK)Ⅱ、 酪蛋白激酶(CK)Ⅱ、PKA磷酸化位点〔18〕。当脊髓髓损伤时丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路被激活，抑制该通路中蛋白的表达后，AQP-4 的表达亦随之发生改变，说明 AQP-4 有可能受到 MAPK 通路的调控〔19〕。有研究显示〔20〕钙调蛋白、PKC、PKG、PKA 等均可在催化AQPs上的特定的丝氨酸残基(Ser111)或 Ser180 磷酸化从而使 AQP的活性上升，增加膜对水的通透性。同时有脊髓损伤的相关研究显示AQP-4表达受 MAPKs 信号通路的控制，当阻断 MAPKs 信号通路后，AQP-4在 BSCB 中血管周围的星形胶质细胞及毛细血管内皮上的表达及脊髓水肿程度均发生明显变化〔21，22〕。证实 MAPKs 通路确实通过调控 BSCB 中AQP-4的表达，干预了脊髓损伤后水肿的形成与消退。深入研究发现，PKC 抑制剂可抑制磷酸化表达，PKC发挥作用的信号转导途径可能在AQP-4表达的转录水平而不涉及蛋白质的从头合成〔23〕，提示相关信号通路调控 AQP-4 mRNA 的表达变化可能是通过转录因子进行的，而这种转录因子有可能是一个新的“神经保护用因子”，在 SCI 早期脊髓水肿的防治中发挥作用。

3.2长链非编码RNA(lncRNA)MALAT1对AQP-4调控防治SSCI lncRNA作为非编码蛋白质的新型基因表达调控因子，参与生物体的各种生理及病理过程。MALAT1是张海天等〔24〕发现的一个反义 lncRNA，位于 11 号染色体，是有丝分裂进程所必须的基因。其在促进癌细胞侵袭和增殖方面发挥重要作用。研究发现 MALAT1 在血管内皮细胞的生理病理变化中起关键调控作用，通过抑制 MALAT1 的表达，可增加内皮细胞基础出芽和促进细胞迁移，反之 MALAT1 过表达可抑制内皮细胞出芽。并且运用 GapmeR(lncRNA 的抑制剂)、siRNA 分别干扰 MALAT1 表达后，再用血管内皮生长因子(VEGF)刺激血管内皮细胞，均可诱导内皮细胞不连续的出芽生长，影响细胞周期进程，使细胞分裂期 S 期减少〔25〕。研究表明〔26〕MALAT1可通过调控 VEGF 的表达促进间充质干细胞的血管新生，说明在体外实验中，MALAT1 可影响内皮细胞出芽、迁移和增殖。在小鼠单侧下肢缺血模型中，抑制MALAT1可减少血流的恢复和后肢局部缺血后毛细血管的密度〔27〕。由此证实MALAT1促进血管内皮细胞增殖、新生血管化、促进损伤后血流恢复和毛细血管密度的作用。同时，在神经再生的研究中发现MALAT1可通过介导PKC增加脑损伤中神经元的成活率〔28〕，且可通过激活细胞外调节蛋白激酶 (ERK)/MAPK 信号通路，在神经生长早期发挥关键作用〔29〕，说明lncRNA MALAT1 可能是 MAPK 家族信号通路的上游调控因子，参与了神经损伤后的修复与重建，加之其在毛细血管内皮调控方面发挥的重要作用，推测MALAT1 可能是脊髓损伤后调控 AQP-4 的表达的关键转录因子。

综上，SCI疾病病理机制具有可变化性，治疗方案复杂多样。尽管SCI发生生理、病理机制已逐渐被掌握，但是针对该疾病的治疗目前仍只能治其表，未能达到治本的效果〔30〕。对于SSCI的防治，是目前仍需首要解决的问题，其直接影响后期神经轴突的再生及肢体感觉功能的恢复及重建。如何减轻脊髓水肿、降低椎管内压力、提高血液的再灌注是治疗SCI首要解决的问题。目前已有研究表明AQP-4参与水分可进出在BSCB或神经兴奋、SCI后星形胶质细胞的迁移、轴突再生等功能，已作为调控水分再平衡及参与SSCI后脊髓水肿及消退的重要信号蛋白〔31〕。本研究发现，在急性脊髓损伤初期，AQP-4表达下降相对伴随脑水肿的减轻，脊髓损伤后水肿的严重程度与AQP-4表达的呈正相关。如何调控AQP-4的表达是减轻神经细胞凋、减轻脊髓水肿、促进轴再生的首要关键问题。实验研究表明lncRNA是高度异变并且具有高度的功能多样性，其主要功能依赖于RNA分子符合不同结构和分子相互作用的能力。此外lncRNAs表达还与人类许多疾病密切相关，包括癌症和心血管和神经变性疾病〔32〕。lncRNA参与SSCI主要的表达基因为MALAT1，此因子为lncRNA的反义因子〔33〕，促进内皮细胞的生长、间充质干细胞的血管新生及SCI后血流的恢复等方面均发挥着重要的作用。同时，MALAT1能增加脑损伤中神经元的成活率，并且通过ERK/MAPKs 信号通路的调节，促进神经细胞的生长。因此推测其与AQP-4之间或许存在一定关联。ERK/MAPKs 信号通路的调节、AQP-4 的表达与 BSCB 损伤后的水代谢及神经修复密切相关，但具体基因调控机制尚不明确。目前，国内有学者采用中医辨证论治的理念对 SSCI 的防治展开相关研究，但对该病的中医病因病机认识不同，治疗侧重点不同，未形成统一的、行业内认可的辩证标准，阻碍了中医药防治本病的进一步发展，影响了中医药结合中医辨证论治理论优势的发挥和学术交流。