Kupffer细胞亚群在肝脏热缺血过程中的作用的研究进展*

王 涛 综述，严启航，黄汉飞 审校

(昆明医科大学第一附属医院器官移植中心 650032)

枯否细胞(Kupffer cells,KCs)作为肝脏常驻巨噬细胞，在肝脏稳定时期，曾被认为是由造血干细胞分化而来。但近期的研究表明，他们在胚胎时期就已定植于肝脏组织，是由卵黄囊(yolk sac,YS)衍生而来，并且可以自行更新、增殖[1-2]。当肝脏发生病变时，如发生感染性炎症或者非感染性炎症，KCs立即反应，从而被大量消耗，而由此触发KCs的补充主要源自骨髓单核细胞(bone marrow monocytes,BMM)[3-5]。所以，依据这些研究的成果，现在对于肝巨噬细胞已经提出了亚群的概念，不同来源的KCs在肝脏中定植、成熟之后的功能以及他们对肝脏受损所表现出来的反应都有所不同[6]。

1 缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI)对肝脏的影响

肝脏IRI是缺血一段时间后恢复组织的血液循环所引发的促炎反应。IRI是肝脏移植后早期同种异体移植功能障碍(early allograft dysfunction,EAD)的主要原因，也因此造成了供体器官短缺的问题，其中以热缺血阶段的损伤尤为突出[7]。但是目前的研究对IRI的机制仍知之甚少。在心脏死亡供体热缺血病理生理改变的过程中，依据两大研究机构Birminghan和Zurich对功能性供体热缺血损伤时间的定义，即从收缩压下降至50 mm Hg以下到供体的冷主动脉灌注所持续的时间[8]，可以发现在热缺血阶段，肝细胞经历了低压灌注及低供氧的过程。最新研究表明，肝脏经过IRI可引起肠道微生物菌群的改变，进而影响移植肝的质量[9]，并且一旦发生热缺血，肝脏细胞内质网应激反应立即启动[10-11]，由此导致肝细胞、KCs等功能发生改变，引起肝细胞的程序性死亡和坏死[12]。

2 KCs的亚群对肝脏热缺血的反应

2.1 YS衍生而来的KCs(YSD-KCs)对热缺血的反应

2.1.1YSD-KCs作为先天免疫的第一道防线，可持续监测造成肝组织损伤的因素

在肝脏处于稳定期的时候，此时定植于肝血窦的KCs是由卵黄囊衍生而来的。KCs核心功能之一是持续监测对肝组织完整性构成威胁的感染性或者非感染性因素[13]。而且KCs通过识别与模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)相结合的损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs)或者病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)来感知肝损伤，然后活化形成炎性复合体，从而激活促炎级联反应[14]。

KCs持续监测的作用源自于其固有免疫细胞的身份。作为先天性免疫的第一道防线，其细胞膜表面镶嵌着多种模式识别受体——Toll样受体(Toll like receptors,TLRs)和NOD样受体(NOD-like receptors，NLRs)用以识别DAMPs[15-16]与PAMPs[17]。所以，经历热缺血之后，被模式识别受体所识别从而激活YSD-KCs的DAMPs主要来自于受损的肝细胞，包括ATP，尿酸，胆固醇晶体，DNA片段以及脂肪酸等[18-19]。

在肝脏热缺血时，高迁移率族蛋白1(high mobility group box 1,HMGB1)和组蛋白/DNA复合物是最具特征的DAMPs。HMGB1作为染色体蛋白质，只有被动的从坏死细胞中释放出来或者经过刺激后从免疫活性细胞中主动分泌，才能作为DAMPs被TLR4所识别，从而激活YSD-KCs[20-21]。而此时在其他DAMPs的作用下，通过不同的PRRs促进YSD-KCs形成多种炎性复合体，其中最具特征性的炎性复合体是NOD-、LRR-和NLRP3[19]。例如ATP通过YSD-KCs膜表面受体P2X7，诱导NLRP3炎性复合体依赖性应答，从而招募pro-caspase-1并且使两个相邻的pro-caspase-1发生自身水解，产生具有酶活性的caspase-1,对白细胞介素-1β(IL-1β)和IL-18的前体进行切割，使其由前体形式转变为活化形式，分泌到细胞外发挥生物学功能，还能引起细胞的caspase-1依赖性炎症坏死，诱导细胞在炎症和应激的病理条件下死亡[22]，并且由此还可刺激活化的KCs释放PGE2和HMGB1到细胞外发挥作用[14]。

2.1.2YSD-KCs可稳定肝祖细胞，保护肝脏的再生能力

当肝脏发生损伤时，依据损伤的原因及程度，肝细胞有两种途径进行再生重建。当发生急性损伤时，可通过已有的正常肝细胞复制分裂以补充损失的肝细胞[23]；当发生慢性损害时，则调用肝祖细胞 (liver progenitor cells,LPCs) 进行增殖分化，从而恢复肝组织的功能结构[24]。在肝脏再生过程中，YSD-KCs作为常驻巨噬细胞，维持肝祖细胞的稳定至关重要。ELSEGOOD等[25]研究表明，YSD-KCs的耗竭会降低LPCs的有丝分裂原水平，从而抑制LPCs的增殖分化，同时，趋化单核细胞浸润的速度减慢。

2.1.3YSD-KCs可分泌趋化因子诱导骨髓单核细胞迁移至肝脏定植，并促其分化

YSD-KCs作为肝脏初始组织损伤的传感器，活化之后可分泌一系列细胞因子、趋化因子、前列腺素、白三烯及补体因子[26]。对于将白细胞募集到炎症区域，趋化因子起到了非常重要的作用。YSD-KCs分泌的趋化因子CXCL1、CXCL2和CXCL8吸引嗜中性粒细胞浸润；同时，其分泌的CCL1、CCL2、CCL25和CX3CL1可趋化骨髓单核细胞浸润[27]。另外，由YSD-KCs分泌的肿瘤坏死因子(TNF)及IL-1可激活肝星状细胞和肝窦内皮细胞，并通过肝星状细胞分泌的集落刺激因子1(colony-stimulating factor 1，CSF1)的诱导，肝窦内皮细胞中Notch信号通路的调节，以及在两者中均发挥作用的骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)的参与，从而使骨髓单核细胞在肝脏定植成熟之后即演变为KCs[28-29]，进而开始发挥其促炎或抗炎的作用[6,30]。

2.2 BMMD衍生而来的KCs(BMMD-KCs)对热缺血的反应

2.2.1BMMD-KCs的促炎效应

作为肝脏巨噬细胞的另一个亚群的来源，当发生肝脏热缺血时，在趋化因子的作用下，骨髓单核细胞迁移至肝血窦内定植，在肝血窦的微环境的作用下开始分化演变为KCs，即BMMD-KCs[31]。

面对肝脏热缺血所产生的病理生理变化，由于线粒体功能障碍和氧化应激反应，使得F4/80+CD68+KCs产生大量活性氧(reactive oxygen species,ROS)，介导肝细胞的凋亡和自噬[29]。KEESTRA GOUNDER等[32]提出，在骨髓来源的巨噬细胞中，内质网(ER)应激可增加肌醇需要蛋白1α(inositol-requiring protein 1 alpha,IRE1α)的表达，IRE1α表达增加可促进细胞内TNF受体相关因子2(TNF receptor associated factor 2,TRAF2)的募集，从而诱导核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)活化，释放许多促炎因子发挥炎性损伤作用。同时，有研究指出，ER应激过程也正是由ROS介导，参与该过程的相关蛋白质还包括相对78×103分子量的葡萄糖调节蛋白(78-kDa glucose-regulated protein,GRP78)、蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)、真核起始因子2-alpha(eukaryotic initiation factor 2-alpha,eIF2α)、激活转录因子4(activating transcription factor 4,ATF4)、c-Jun N-末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、p38和CCAAT-增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT-enhancer-binding protein homologous protein,CHOP)等[10]。XU等[33]指出，在肝脏IRI过程中，可以利用ER应激抑制剂即牛磺熊去氧胆酸(tauroursodeoxycholic acid,TUDCA)或IRE1α激酶抑制剂来抑制KCs的功能，下调IRE1α/TRAF2/NF-κB通路的活性，从而减轻肝脏IRI。

2.2.2BMMD-KCs的抗炎效应

血红素加氧酶催化血红素转化为3种活性终产物，即胆绿素/胆红素，CO和亚铁离子。血红素加氧酶有3种亚型，即HO-1、HO-2和HO-3。HO-1由一系列刺激因素诱导，如ROS、一氧化氮(NO)、内毒素、亲电子药物、细胞因子、缺氧和紫外线照射等[34]。加州大学David Geffen医学院Dumont-UCLA移植中心研究指出在肝脏热缺血的过程中，组织中BMMD-KCs是HO-1的主要来源，BMMD-KCs可以通过HO-1来发挥抗炎作用[35]。

HO-1作为抗氧化剂，诱导其高表达是目前公认的对抗炎症、体温过高及IRI的关键细胞保护机制。而且，HO-1是维持细胞内氧化还原稳态的关键生物活性化合物[36]。关于HO-1的表达，涉及的转录因子包括激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)、核因子红细胞相关因子-2(nuclear factor erythroid related factor-2,Nrf2)、the cap ′n′ collar basic region leucine zipper蛋白家族(CNC-bZIP)。另外，NF-κB和v-Maf癌蛋白也可以与HMOX1基因的启动子区相结合，从而调节HO-1的表达。其中，转录因子Nrf2是HO-1转录的主要正调节物[37]。在无损伤情况下，Nrf2基本上是被细胞质中的Kelch样ECH相关蛋白(Kelch-like ECH-associated protein,Keap1)所隔离，即Keap1通过基于Cullin 3的E3泛素连接酶复合物与Nrf2相互作用，使其不发挥功能。氧化应激后，Keap1-Nrf2复合物被解离，Nrf2则易位至细胞核并且与HMOX1基因启动子中的应激反应元件/抗氧化反应元件(StRE/ARE)位点结合，促进其转录[38]。

加州大学David Geffen医学院Dumont-UCLA移植中心研究还指出，在肝脏热缺血期间，在可替代阅读框Arf依赖的条件下，由BMMD-KCs产生的HO-1通过SIRT1/p53信号通路，可以抑制单核巨噬细胞活化标志物p-STAT1和iNOS的表达，进而抑制单核巨噬细胞的促炎表型，保护移植肝成活率，减少肝细胞的损伤[35,39]。

另外，值得注意的是，HO-1产生的终产物CO，是目前为止人体内少有的可以抗炎的气体分子之一。KIM等[40]发现，CO可通过激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号传导途径，从而使糖原合成酶激酶-3( glycogen synthase kinase-3,GSK3)发生磷酸化，抑制其活性，由此提高肝脏IRI过程中肝细胞的存活率[40]。同样有研究表明，在KCs中，CO可上调热休克蛋白70(HSP70)并抑制ROS的产生，并且显著抑制MEK/ERK1/2通路，以及调节IRI诱导的STAT1和STAT3活化[41]。CO还可抑制纤维蛋白溶解信号轴，下调促炎因子早期生长反应-1(early growth response 1,Egr-1)[42]，激活过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(peroxysome proliferator activated receptor-γ,PPAR-γ)发挥抗炎作用[43]。

3 总结与展望

对于KCs，无论哪一个亚群，目前都无法确切地说明其在肝脏热缺血过程中的作用，甚至最新的研究还提到KCs在应激反应过程中还可通过防止免疫应答的过度活化，来保护肝脏的病理性损害[44]，以及肝脏迷走神经通过激活KCs上的α7烟碱乙酰胆碱受体(α7nAChR),抑制KCs，使得IRI诱导的肝细胞凋亡结果最小化[45]。所以，继续探索肝脏常驻巨噬细胞KCs在肝脏损伤发生过程中的作用，是为临床肝脏疾病的治疗提供重要策略的研究方向。