Nrf2/HO-1信号通路在男性不育症中的研究进展*

丁豪帅 综述，张 斌，常德辉△ 审校

(1.甘肃中医药大学临床医学院，兰州 730000；2.中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院泌尿外科，兰州 730050)

氧化应激是指机体组织和细胞内活性氧(ROS)自由基产生过多积聚或抗氧化剂对其清除发生障碍，导致氧化还原系统失衡，引起细胞内核酸损伤、脂质过氧化和蛋白质损伤，致使能量代谢异常，诱发细胞凋亡乃至组织器官功能障碍[1]。为了维持氧化还原反应平衡，生物体内形成了较为完整的抗氧化防御系统。核因子E2相关因子2(Nrf2)是一个关键的转录因子，血红素加氧酶(HO)-1是受Nrf2调控的一个重要的抗氧化酶，它是一种Ⅱ相解毒酶，也是血红素在分解代谢过程中的限速酶，可将血红素分解为一氧化碳、游离铁和胆绿素[2]。近年来研究发现，HO-1为一种机体内源性抗氧化剂和细胞保护酶，它在多系统氧化应激相关疾病中发挥着重要的调节作用。本文就Nrf2/HO-1信号通路在男性不育症中的研究进展综述如下。

1 Nrf2/HO-1概述

Nrf2由7个功能性Neh结构域(Neh1～7)组成，其中氨基末端Neh2结构域对Kelch样ECH相关蛋白1(Keap1)起着调控作用，Keap1是一种氧化应激传感器[3]。在生理条件下Nrf2与Keap1结合于细胞质中,负责Nrf2的细胞质隔离。在ROS及某些亲电子基团诱导的氧化应激条件下，Nrf2和Keap1之间的构象联系发生变化，Nrf2与Keap1解离后进入细胞核内，Nrf2的Neh1结构域与Maf蛋白耦联形成异二聚体后，与抗氧化反应元件(ARE)结合[4]，诱导启动下游多个抗氧化酶系的表达，如：HO-1、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)和醌氧化还原酶-1(NQO1)等，上述蛋白分子参与了拮抗由ROS诱导的氧化应激反应的过程，保护机体免受毒性物质的伤害[5]。

HO是Nrf2调控的Ⅱ相解毒酶之一，有可诱导型HO-1、结构型HO-2及含量甚微尚未明确的HO-3 3种同工酶。研究表明，HO-1及其代谢产物一氧化碳、游离铁和胆绿素在抗氧化过程中发挥着重要作用[6]。Keap1-Nrf2/ARE信号途径的激活，与多种促氧化剂和炎性疾病等因素的刺激有关，这使得Nrf2和HO-1的表达上调，清除过量的ROS，以减轻组织细胞内的氧化应激水平，使内环境氧化还原处于动态平衡[7]。完整的Nrf2/HO-1信号通路通过抗炎、抗氧化、减轻线粒体损伤、调控细胞凋亡、自噬等多种机制，最终影响氧化应激性疾病的转归。

2 Nrf2/HO-1信号通路的作用机制

2.1 抗炎及抗氧化

研究发现，应用抗肿瘤药物多柔比星引起急性或慢性剂量相关性的心肌毒性不良反应，这与药物代谢过程中ROS的产生并诱发细胞内线粒体与核酸氧化损伤、炎性反应、心肌纤维变性等多因素有关[8]。在病变心肌细胞中发现的Nrf2缺失使得氧化程度加重，进一步加剧了心肌病理改变，而早期通过增加Nrf2的诱导进行干预则显示出可减轻这种心肌毒性的损伤。在百里醌改善大鼠肺纤维化炎性反应过程中，Nrf2/HO-1通路起着积极的作用[9]，通过靶向诱导HO-1等抗氧化酶的表达水平，肺组织中促纤维化细胞因子的生成受到了抑制。同时炎性因子释放的减少减轻了氧化应激带来的损伤，从而起到了保护肺功能的作用并延缓了肺纤维化的进展。在小鼠发生脓毒症相关性脑病的早期脑组织标本内可检测到高水平的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)等促炎介质[10]，它们介导了神经中枢炎性因子的释放，引起神经元细胞水肿、结构损伤，导致神经系统功能紊乱。而Nrf2的激活及下游保护性蛋白的检出被证实在氢气预处理用于改善此类小鼠脑损伤的治疗中能够有效抑制炎性因子释放，减轻局部微血管内皮通透性，进而改善了脓毒症引起的脑组织病理性氧化损害。

有学者将HO-1基因敲除模型的小鼠与野生型小鼠置于缺氧、细胞毒素处理的应激环境后，检测到小鼠组织细胞内ROS明显升高，野生型小鼠通过激活Nrf2途径及HO-1表达的上调，降低ROS水平来拮抗自由基的氧化损伤，起到保护脏器结构功能的效应[11-12]。而在HO-1基因敲除小鼠中发现，由于HO-1的缺乏使得细胞抵御氧化损伤的能力低下，ROS清除障碍而导致其更易出现多脏器功能衰竭且预后不良。以上研究均提示了Nrf2/HO-1信号通路具有抗炎与抗氧化的能力，对心肺脑等重要脏器具有保护作用。

2.2 维持线粒体的稳定

线粒体是细胞质内进行物质能量代谢的重要细胞器，ROS是代谢循环中经呼吸链产生的一种副产物，脂滴的形成是细胞受到应激后的重要标志之一。LEE等[13]通过对高氧、缺氧、心肌缺血、败血症的小鼠模型进行了相关研究，证实了上述应激源环境均可破坏线粒体DNA结构与功能的完整性，主要表现为严重的线粒体肿胀和三磷酸腺苷(ATP)能量供应缺乏，线粒体代谢功能发生紊乱可诱导脂滴的形成，这在一定程度上加剧了原有的氧化损伤。YU等[14]发现，细胞在响应内外源性有害因子时，线粒体的生物发生与功能随之出现异常，然而在激活Nrf2后，再次观察应激所导致的线粒体形态与功能障碍得到明显改善，提示了这可能与Nrf2调控相关抗氧化酶的表达，清除线粒体内过多的ROS，从而减轻自身损伤有关。线粒体膜电位水平及通透性的改变也是引起细胞能量代谢异常的重要因素之一，研究发现细胞在受到氧化因素刺激时由于ROS的过多蓄积，使得线粒体膜电位生理屏障遭到破坏，通过进一步对细胞内ATP水平进行评估，证实了HO-1表达水平的提高对于氧化应激状态下线粒体功能完整性的维持起到保护作用，以此来减轻细胞结构与功能的受损[15]。以上研究证实了Nrf2的激活可诱导下游抗氧化基因的表达来调节细胞内ROS的平衡，有助于稳定线粒体膜电位水平，促进脂肪酸氧化、氧化磷酸化和线粒体的生物合成有序进行，重要的是减轻了线粒体的氧化损伤。基于这种发现，应用Nrf2及HO-1的激活剂是否可以作为相关疾病的防治策略，值得更深入思考。

2.3 调控细胞凋亡

细胞凋亡表现为细胞膜完整、染色质断裂与凝集、细胞核皱缩及凋亡小体形成等形态学改变。调控凋亡的基因主要是半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族，Caspase级联反应可被细胞内信号(如，应激)和细胞外信号(如，细胞表面死亡受体及其配体)所启动[16]。因此，凋亡是氧化应激状态下常出现的一种细胞死亡方式。以往研究表明，Nrf2在调控细胞凋亡方面是一把“双刃剑”[17]：(1)在正常细胞内,Nrf2利用其通路特性来抵御氧化损伤、促进细胞适应性修复并防止失控性生长而发挥抗炎、抗肿瘤等作用；(2)Nrf2在恶性肿瘤细胞内又能起到抗凋亡、促进细胞增殖及对化疗药物产生耐药性等不利作用。SUN等[18]发现龙生蛭胶囊在用于大鼠缺血性脑卒中的治疗方面具有减轻神经元细胞损伤、改善中枢功能恢复等作用，通过给予药物预处理后，大鼠脑组织Nrf2、HO-1、SOD、CAT等保护性蛋白上调显著，脂质过氧化标志物丙二醛(MDA)水平明显降低，同时测得凋亡标志物Caspase-3及Bcl-2相关X蛋白(BAX)的水平较前下降，抗凋亡蛋白Bcl-2基因的表达活性增加，凋亡神经元细胞的数量亦呈现减少，这表明了Nrf2/HO-1通路的激活具有抵御细胞氧化损伤及抗凋亡的作用。另有研究指出，Nrf2在结直肠癌癌细胞中可抑制细胞的凋亡，而这种特点在一定程度上增加了结直肠癌对抗肿瘤药物奥沙利铂产生耐药性，导致肿瘤细胞更易增殖扩散并因此增加了肿瘤发生远处转移的可能性，这为抗肿瘤药物的临床治疗带来了新的困难与挑战，同时也为学者提示了一种新的研究思路与方向[19]。基于Nrf2在调控细胞凋亡过程中的作用及如何将这一潜在治疗靶点加以利用，仍需进一步的讨论。

2.4 调控自噬-溶酶体系统

自噬主要利用溶酶体降解自身受损的细胞器等细胞质内大分子来调控内环境稳态。p62是介于自噬与Keap1/Nrf2信号通路之间的关键接头蛋白，在细胞质内p62可与Nrf2竞争性地结合Keap1形成复合物，借助其与Keap1的复合体形式通过自噬-溶酶体途径将Keap1携至自噬体中进行隔离降解，该过程中因Keap1与Nrf2的结合状态受到p62的干扰，Nrf2与Keap1解离后转移至细胞核内并激活下游靶基因的转录过程[20]。研究发现，p62也是Nrf2的调节靶标之一，氧化应激发生后，Nrf2进入细胞核内可与p62启动子上的ARE序列识别结合，p62表达亦出现上调，以上反映出Nrf2与p62之间具有正反馈的调节环路[21]。二者之间的分子作用机制还需进一步探讨，这为后续通过Nrf2调控自噬环节来探索相关疾病防治的策略提供了理论支持和导向。

3 抗氧化信号通路在男性不育症中的研究

3.1 各种抗氧化基因

男性生殖系统在生理情况下存在少量的ROS，这对于精子的发生与正常功能的调节(如：精子获能、顶体反应及精卵结合)必不可少[22]，但在一些内外源性理化因素(如：环境污染、电离辐射、毒素、缺氧、精索静脉曲张、高脂饮食、久坐不动)等作用下，ROS异常增多可使氧化还原系统的平衡被打破而诱发氧化应激的发生，由于精子质膜和细胞质中含有大量的不饱和脂肪酸，因此精子容易受到ROS的攻击[23]。研究发现，男性生殖道中的抗氧化基因酶系主要包括SOD、HO-1、CAT、GSH-Px、谷胱甘肽S-转移酶(GST)和一氧化氮合酶(NOS)等，它们在精子的发生和维持正常精子生理功能中起着重要的调节作用[24]。而Nrf2是内源性抗氧化信号通路中最重要的转录因子之一，Nrf2表达的缺失，可导致一系列抗氧化基因酶系激活障碍，使ROS对精子的病理损害加剧，构成了男性不育症发生的重要原因。

3.2 体内和体外实验

JIANG等[25]研究表明，白藜芦醇能够保护大鼠精母细胞免受脂质过氧化作用，减少生殖细胞的凋亡，促进精子的产生和运动能力的增加，并保护其免受毒素的侵害，其机制被证实与激活Nrf2及其下游抗氧化基因的转录有关。研究发现，骆驼乳清蛋白能降低小鼠睾丸组织热应激损伤后的ROS水平，恢复Nrf2、SOD、GSH-Px、CAT的表达活性，而Bcl-2的下调提示抗氧化基因可能通过降低精子凋亡率来保护睾丸功能并提高生育能力[26]。JIN等[27]发现，当归提取物中的紫花前胡素在实验大鼠单侧隐睾症中主要是通过Nrf2介导的HO-1上调来维持SOD的活性水平，进而减轻精子受到的氧化应激并可提高精子数量与活力，改善隐睾引起的不育症。NAKAMURA等[28]通过对野生型和Nrf2基因敲除模型的小鼠进行研究，发现Nrf2缺失的小鼠曲细精管结构常发生萎缩变性，睾丸及附睾内的精子数量和精子运动能力下降明显，生殖细胞凋亡的水平增高、HO-1等抗氧化酶水平低下，提供了氧化应激对睾丸和附睾具有不利影响的相关证据，提示了转录因子Nrf2在防止精子发生氧化损伤中具有关键的作用，抗氧化酶的上调能有效降低睾丸与附睾中的氧化应激水平，表明Nrf2可被考虑作为一种预测ROS相关男性不育症的生物标志物。以上关于体内和体外实验的结果，为激活Nrf2抗氧化通路可以防御氧化应激损伤这一理论提供了进一步的支持。

3.3 Nrf2与男性不育

临床调查中，约15%的育龄夫妇被不育问题所困扰，其中，由于男性原因引起的不育症约占50%，这已成为影响人类健康的一个社会问题[29]。随着生殖医学研究的深入，氧化应激已被公认为是引起男性不育症的重要因素之一，近年来成为一项关注的热点。高水平的脂质过氧化反应作为氧化应激的标志之一，同时也是造成精子结构破坏、DNA损伤断裂和异常凋亡的重要环节，由此带来的精子产生与成熟障碍、活动度与受精能力低下等影响均可导致男性不育症的发生[30]。

研究发现，不育症男性的精浆较可育男性组存在明显高水平的ROS及低水平的抗氧化酶表达[31]。与此同时，精子DNA碎片化指数的增高证实了氧化应激与精子DNA损伤之间存在一定的关联性，因此，相关氧化物质及抗氧化基因酶系的水平可被考虑作为评估精子质量并预测生育能力的有效指标。CHEN等[32]研究发现，与正常男性对照组相比，少精、弱精症患者精液中Nrf2 mRNA的表达量普遍缺乏，SOD、CAT的活性低下，测得精子浓度、向前运动精子百分率、存活率等指标明显低于对照组，这提示经Nrf2转录的抗氧化酶在清除ROS对精子的氧化损伤方面具有重要的地位，Nrf2表达的水平与精液分析相关参数指标存在正相关性。BARIK等[33]开展的一项基于男性不育症人群应用抗氧化剂的干预性研究显示，受试者在进行90 d的抗氧化治疗后，复查精浆总抗氧化剂水平明显增加，ROS水平趋于降低，MDA水平较干预前显著下调，精子形态、数量、运动能力等指标均得到一定程度的改善。该研究结果表明了ROS必须控制在适当的水平以维持精子正常的生理功能，同时还应避免过高而对精子产生的病理性损害。

3.4 抗氧化剂在男性不育症中的应用

近年来，随着男性不育症防治研究的开展，抗氧化治疗措施引起了人们的关注。研究发现使用姜黄素能够提升弱精症男性精液中Nrf2的表达，并降低原有高水平的ROS，提高精子活力来发挥抗氧化作用，而在给予鸦胆子苦醇(一种 Nrf2的抑制剂)后，Nrf2蛋白水平降低，精子运动能力明显低于姜黄素组[34]。有学者发现补充维生素C可使睾丸中Nrf2表达增加、精子细胞畸形率与凋亡率得到减少，起到改善精子质量的疗效，据此推测维生素C作为一种众所周知的清除自由基的抗氧化剂，它在提高男性生育能力方面可能具有一定的作用[35]。研究表明硫辛酸可通过改善线粒体的能量代谢过程来减少ROS生成，进而减轻睾丸与附睾的氧化损伤，为精子的产生与成熟提供良好适宜的微环境，可作为治疗少弱精子症的有效选择[36]。基于以往研究，抗氧化剂可以减少男性生殖系统ROS的蓄积，通过靶向激活Nrf2/HO-1信号通路的抗氧化治疗，未来可能成为提高精子质量、治疗男性不育症的有效路径。

4 展 望

男性不育症是临床工作中的一类常见病，发病机制涉及炎性因子、线粒体损伤、细胞凋亡、自噬等方面，并与多种抗氧化蛋白分子之间存在复杂的联系。男性生育能力的低下与生殖系统中氧化损伤的增加和抗氧化能力的下降有关，虽然现有大多数证据强调了Nrf2/HO-1信号通路独特的抗氧化活性，一些相关靶向抗氧化剂亦逐步用于治疗男性不育症，但目前具体的实施策略尚缺乏明确的共识，这可能是由于不同抗氧化剂的组合方式、适宜浓度剂量、给药周期及有效性指标监测等方面存在较大个体差异。

因此，在未来的研究中，研究者需要在细胞和动物模型中开展分子水平更深入广泛的研究，并注意Nrf2/HO-1抗氧化信号通路中各蛋白分子表达与精液分析等指标的关系，对于指导抗氧化药物的开发应用与推广，以及男性不育症的临床预防和治疗仍是必要的。