细胞微粒在慢性阻塞性肺疾病中的研究进展*

张俊鸿， 熊 玮

［陆军军医大学（第三军医大学）第一附属医院老年医学与特勤医学科，重庆400038］

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmo⁃nary disease，COPD）以持续呼吸道症状和不可逆气流受限为特征，是目前世界上第四大死亡原因，预计到2030年每年死于COPD和相关疾病的达450万人［1］，给全球带来巨大经济和社会负担。目前COPD的病理机制包括氧化细胞机制、氧化应激、衰老、线粒体功能异常等假说，但确切机制仍存在争议。一直以来COPD主要依靠临床症状及肺功能检测诊断［2］，但存在漏诊及过度诊断问题，治疗方面以症状控制及疾病进展延缓为主，尚未发现能治愈COPD的药物，所以迫切需要进一步研究COPD的发病机理，寻找新的生物标志物和治疗靶点。

细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是各种类型细胞在生理状态、应激、损伤或凋亡情况下释放到细胞外环境中的囊泡，根据其大小可分为外泌体、微粒（microparticles，MPs）、凋亡小体等。MPs也称微泡、胞外体、脱落囊泡等，直径0.1~1µm，其内含有mRNA、miRNA、蛋白质、脂质等活性成分。很多研究表明MPs通过转移其内容物介导细胞间通讯，调节信号转导、炎症反应等，参与疾病的发生发展，近年研究认为MPs也是COPD病理机制之一。本文对MPs介导的COPD发病机制的研究进展进行综述。

1 COPD中常见的微粒及其活性

MPs在细胞间的交流中起着重要的作用，影响包括COPD在内的许多疾病，研究显示COPD患者循环、肺泡灌洗液及痰液中细胞MPs增加，可能参与COPD的发生发展。

1.1 淋巴细胞来源的MPs（lymphocyte-derived MPs，LMPs）COPD是一种慢性气道炎症性疾病，淋巴细胞等炎症细胞增加，炎症机制在COPD的发生发展中起关键作用［3］。LMPs是淋巴细胞受到活化或凋亡时从浆膜上脱落的直径0.05~1µm的小囊泡颗粒，含有多种特异性膜糖蛋白和生物学活性受体［4］，其数量的增加与免疫和炎症性疾病的病理状态有关。COPD中增多的LMPs聚集在支气管上皮细胞（bron⁃chial epithelial cells，BECs）表面，可能诱导BECs的损伤。

临床COPD患者肺泡灌洗液中LMPs病理性升高，且LMPs的量与疾病的严重程度有密切关系，进一步动物实验证实LMPs促进C57BL/6小鼠的气道炎症［5］。体外研究显示LMPs抑制人BECs生长，使细胞周期阻滞在G1期［6］，同时导致BECs的炎症介质［包括肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）和IL-8等］增多，并通过p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-ac⁃tivated protein kinase，p38 MAPK）信号通路诱导BECs凋亡，促进氧化应激［7-8］。近来研究表明T淋巴细胞来源MPs抑制自噬，诱导BECs分泌炎症因子（IL-1β、IL-18等），导致核苷酸结合寡聚化结构域样受 体 蛋 白3（nucleotide-binding oligomerization do⁃main-like receptor protein 3，NLRP3）炎症小体形成和积聚［9］，调节COPD炎症反应。

目前体内外实验已证实LMPs可对BECs发挥抑制生长、促炎和促凋亡的作用，可能作为COPD患者气道炎症及BECs损伤的有害生物标志物。但LMPs中包含有丰富的脂质、蛋白质和核酸成分，其发挥作用的具体成分仍需要进一步研究，才能为COPD的治疗提供更精准的靶点。

1.2 BECs来源的MPs BECs是抵御有害物质的第一解剖气道屏障，气道上皮组织能产生跨膜型黏蛋白（transmembrane mucins，transmembrane MUCs），保持上皮表面湿润，保护上皮免受病原体和环境刺激的影响，BECs来源的MPs中含很多不同MUCs（MUC-1、MUC-4和MUC-16等），能发挥中和H1N1流感病毒的作用［10］。因此，BECs来源的MPs可能与正常气道生物学机制的调节有关。

COPD的部分特征是上皮-间充质转化（epithe⁃lial-mesenchymal transition，EMT）相 关 的 气 流 受限［11］。EMT可能导致气道成纤维细胞产生，导致气道重塑与气流受限。人BECs来源的EVs能参与COPD上皮-成纤维细胞的异常交互作用，临床研究表明COPD患者血清总EVs中miR-21水平较高，而在体外实验中经香烟烟雾提取物处理的BECs来源的EVs中miR-21含量较低，这种EVs通过减轻M2巨噬细胞极化，改善COPD发病机制中EMT而减轻气道重塑［12］，同时在COPD小鼠模型中证实下调BECs来源EVs的miR-21可以减轻香烟烟雾诱导的小鼠气道重塑［13］。所以上皮细胞来源的EVs可能是COPD中一种新的减轻EMT的代偿保护机制。

COPD是加速衰老的肺部疾病，表现出上皮细胞衰老、线粒体功能障碍等衰老相关特征。衰老的BECs可分泌含有很多炎症因子（IL-6、IL-8等）的MPs，这些MPs具有衰老相关分泌表型的功能，被认为是一种新的衰老相关的分泌表型，在促进炎症发展、衰老和氧化应激中起着重要作用［14］。最近研究显示，经LMPs处理的视网膜色素上皮（retinal pig⁃ment epithelium，RPE）产生RPE来源的MPs（RPE-derived MPs，RMPs），影响上皮细胞的衰老及吞噬功能，参与衰老相关的病理改变［15］。而在COPD中LMPs能促进BECs分泌MPs，而这些BECs分泌的MPs是否参与衰老的病理改变及其具体调控机制可能值得进一步研究。

1.3 内皮细胞来源的MPs（endothelial cell-derived MPs，EMPs） 临床研究表明，COPD患者循环中的EMPs含量增加［16］，且与吸烟和COPD有关，健康吸烟者戒烟后血浆EMPs的水平能恢复到不吸烟者的水平，不改变吸烟状态的受试者血浆EMPs水平在1年内保持稳定，而COPD吸烟者戒烟后血浆中EMPs水平在1年内仍然显著升高［17］。这种EMPs含量的增加可能与肺毛细血管内皮细胞损伤有关［18］。近年来Takahashi等［19-21］发现，COPD患者循环血中的EMPs（CD144+、CD31+/CD42−和CD62E+）含量增加水平与疾病严重程度正相关；同时EMPs（CD62E+和CD144+）水平与第一秒用力呼气容积（forced expiratory volume in 1 s，FEV1）变化呈显著负相关，稳定期COPD患者EMPs（CD62E+）水平高预示FEV1快速下降。还有研究表明，痰液中EMPs（CD31+）水平升高与肺损伤之间存在相关性［22］。此外，EMPs作为旁分泌或内分泌因子参与细胞间通讯可能参与COPD的发病，肺血管内皮细胞通过EMPs向肺泡上皮细胞转运保护性α1-抗胰蛋白酶（alpha-1 antitrypsin，AAT）［23］。AAT是血清中主要的一种蛋白酶抑制剂，在COPD等炎症性疾病时，AAT能透过毛细血管到组织液中，上皮细胞内化AAT可保护肺免受弹性蛋白酶和炎症的影响，而AAT水平降低可导致呼吸困难及肺气肿发生。

上述研究结果提示，COPD患者存在持续的内皮细胞激活和损伤，从而导致EMPs的稳定释放，而释放的这些特定的EMPs亚群可能作为COPD患者诊断分级以及病情恶化易感性的潜在生物标志物，同时近来研究认为香烟烟雾引起的内皮功能障碍/损伤与COPD（特别是肺气肿）的肺部损害以及包括肺动脉高压、动脉粥样硬化和慢性肾损伤等COPD并存疾病密切相关［24］，但EMPs在疾病中的确切作用机制仍需要进一步研究。

1.4 单核/巨噬细胞来源的MPs 单核/巨噬细胞在不同生理及病理状态下也能产生MPs，可能与COPD的发病机制相关。Tokes-Fuzesi等［25］通过比较健康者、稳定期和急性加重期COPD患者循环中单核细胞来源MPs（CD45+、CD13+、CD14+和CD56+）的水平，显示单核细胞来源的MPs在病情恶化中起着重要作用，在COPD患者中单核细胞MPs均显著高于健康对照组，而且COPD急性加重期MPs（CD14+）水平显著高于稳定期COPD，并与FEV1呈显著负相关。在体外实验中单核/巨噬细胞来源的MPs上调人BECs炎症介质［IL-8、单核细胞趋化蛋白1（macrophage che⁃moattractant protein-1，MCP-1）和细胞间黏附分子1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）］合成，介导COPD气道炎症反应［26］，并且显示巨噬细胞来源的MPs含有基质金属蛋白酶，具有明胶溶解和胶原溶解活性，与肺气肿发生有关［27］，而使用基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）抑制剂能抑制单核巨噬细胞MPs的释放及其蛋白水解活性［28］。单核/巨噬细胞释放的MPs可能作为COPD潜在的诊断及严重程度分级的循环生物标志物，并且为COPD提供了其他可能的治疗方式。

2 MPs作为COPD的潜在诊断生物标志物

根据COPD的GOLD诊断和治疗策略，任何有呼吸困难、慢性咳嗽或排痰，和（或）有暴露于该疾病危险因素的病史，应临床考虑COPD，再结合肺活量测定吸入支气管扩张剂后FEV1/用力肺活量（forced vi⁃tal capacity，FVC）<0.70来确诊。虽然肺活量测定是一项简单的测试，但COPD在年轻患者中可能会被低估，在老年患者中可能会被过度诊断［29］。同时，COPD现在被广泛认为是一种复杂的异质性疾病，在评估COPD患者时，根据预后和治疗反应确定临床表型以选择最佳治疗方案是很重要。因此，研究新的COPD生物标志物以补充肺功能测定很有必要。

目前研究表明，某些类型的EMPs是COPD潜在的生物标志物，EMPs水平的增加可能反映肺毛细血管内皮细胞的损伤。COPD患者循环中EMPs（CD144+、CD31+/CD42−和CD62E+）含量增加的水平与疾病严重程度正相关，且痰液中EMPs（CD31+）水平升高，与FEV1呈负相关［19-22］。

近年来许多临床研究分析痰及血循环中miRNA图谱以预测和诊断COPD。与健康对照组相比，COPD患者痰液中let-7c和miR-125b的表达水平降低［30］，血清miR-21和miR-181a水平升高［31］。最近Sundar等［32］对不吸烟者、吸烟者和COPD患者血浆来源的EVs进行miRNA谱分析，发现COPD患者较吸烟者或不吸烟者上调的miRNA有miR-22-3p、miR-99a-5p、miR-151a-5p、miR-320b和miR-320d，下调的有miR-335-5p、miR-628-3p、miR-887-5p和miR-937-3p，并在经香烟烟雾处理的BECs分泌的EVs中得到验证。所以EVs中的miRNA可作为COPD新的生物标志物，COPD患者miRNA的分子图谱对寻找COPD诊断及治疗的特异生物标志物具有重要意义，但是miRNA发挥作用的具体机制仍需要进一步研究。

此外，最近有研究提出血浆EVs的表面蛋白质分析可以作为鉴别及诊断COPD的一种无创方法。Jung等［33］比较了健康对照者、社区获得性肺炎（com⁃munity-acquired pneumonia，CAP）患者和COPD急性加重（acute exacerbation of COPD，AECOPD）患者的血浆样本，显示血浆EVs的表面蛋白质修饰在组间有显著差异，在ROC分析中，CD45和CD28是CAP和AECOPD的鉴别标志物，进一步通过CD45、CD28、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（cytotoxic T-lympho⁃cyte-associated protein 4，CTLA4）、TNF和CD16的组合又可以区分CAP和AECOPD。这提示血浆EVs的特异蛋白质组成可能对COPD的诊断及鉴别有意义。

3 MPs作为COPD可能的治疗靶点

MPs可通过将内容物分子转移到远处的受体细胞而改变受体细胞，所以MPs有望成为一种新的治疗靶点。近年针对MPs的治疗策略主要有：（1）消除含有核酸或蛋白质的MPs（作为参与疾病发病机制的细胞内通讯介质）；（2）利用MPs作为肺再生或免疫调节剂的来源；（3）利用MPs作为药物递送介质。

消除MPs可以通过捕获循环中的MPs、干扰受体细胞对MPs的摄取以及抑制MPs的产生或分泌来实现［34-35］。Fujita等［36］的研究表明，人BECs来源的EVs中miR-210可通过阻断自噬相关基因7（autopha⁃gy-related gene 7，ATG7），促进肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，从而引起COPD患者气道重塑，因此消除表达miR-210的EVs可能有助于抑制气道重塑。此外，体外实验结果显示，通过MMPs抑制剂抑制单核细胞MPs的产生可能有助于减轻肺部炎症，缓解肺气肿的变化［28］。

MPs在作为肺再生或免疫调节剂方面的也已有所 应 用 。Lener等［37］将 间 充 质 干 细 胞/基 质 细 胞（mesenchymal stem/stromal cells，MSCs）衍生的MPs（MSC-EVs）作为一种治疗方式。骨髓MSCs是一种多能非造血细胞，具有分化为多种细胞类型的潜能。近来人们发现骨髓MSCs具有抗炎和（或）免疫抑制、协调组织再生等潜能；而到目前为止，许多研究表明，MSCs衍生的MPs与MSCs具有相同的功能。比如在卵清蛋白（ovalbumin，OVA）诱导的严重哮喘小鼠过敏模型中，MSC-EVs能减轻肺部炎症及气道胶原沉积［38］；de Castro等［39］的研究表明，MSC-EVs能减轻曲霉菌诱导小鼠Th2/Th17介导的气道炎症和高反应性。

MPs作为药物递送介质，目前主要是人工合成纳米MPs联合药物或者miRNA以吸入的方式对COPD起治疗作用［40-42］。但是目前多集中于MPs治疗癌症方面的报道，细胞MPs治疗COPD的研究报道很少，还需要进一步研究来确定MPs治疗COPD的特异性效应。

4 COPD背景下MPs致病可能成分讨论

MPs作为细胞受到刺激活化或凋亡后形成的纳米囊泡，参与COPD炎症调节、气道重塑等病理生理过程，但是MPs中富含脂质、蛋白质及核酸等生物活性成分，且不同状态细胞来源的MPs成分又不相同，那么不同MPs中具体哪种成分发挥作用仍不清楚。目前研究主要报道了MPs中miRNA及蛋白质成分在COPD中的作用，如人气道上皮细胞来源的EVs中miR-21参与吸烟诱导的COPD上皮-成纤维细胞的异常交互作用［13］；此外MPs中蛋白质成分如MUCs、MMPs也在COPD中发挥作用。然而脂质作为MPs的基本结构成分，其作用尚未明确。很多研究表明，鞘磷脂代谢产物［如神经酰胺和鞘氨醇-1-磷酸（sphingosine-1-phosphate，S1P）］控制着肺内关键的细胞信号事件，这些信号事件可能通过香烟烟雾诱导的鞘磷脂失衡，导致肺泡上皮细胞和BECs增殖、炎症反应、凋亡和衰老［43-45］，所以有研究提出血浆脂质包括鞘脂及代谢产物是COPD的潜在生物标志物，可能为COPD诊断及严重程度分级提供一种方法［46］。近来Serban等［47］发现，香烟烟雾诱导释放的EMPs和循环MPs（circulating MPs，cMPs）富含神经酰胺，而S1P的含量相对减少，所以MPs中的某些脂质包括鞘脂代谢物可能作为COPD潜在的生物标志物，但需要进一步研究具体脂质成分及其作用机制。

综上所述，MPs通过不同的方式参与COPD的发生发展，具有作为COPD诊断及严重程度分级的生物标志物的潜力，且MPs中的某些成分如miRNA、MMPs等在COPD中发挥作用，为COPD精准治疗提供了参考依据。但是MPs成分随细胞类型、病理生理背景、接受测试的对象、给予的不同刺激波动、基因表达的变化而变化，而且MPs的鉴定、分离、提取、内容物如脂质成分的分析仍存在技术挑战，因此MPs在COPD中的作用仍存在争议。COPD中MPs的作用仍需进一步研究，以明确MPs与COPD病理生理的确切关系及寻找新的潜在生物标志物和临床治疗靶点。