2019冠状病毒病相关血栓形成的研究进展*

沈国民， 沈 滟， 杨海平

（1河南科技大学基础医学院，河南省血栓与止血国际联合实验室，河南洛阳471023；2河南科技大学第一附属医院血液科，河南洛阳471023）

新型冠状病毒肺炎（2019 冠状病毒病，coronavirus disease 2019，COVID-19）是由新型冠状病毒（严重急性呼吸综合征冠状病毒2，severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2；简称新冠病毒）引起的一种呼吸系统传染病，是目前人类面临的最大的公共卫生问题。起初，COVID-19 被认为主要引起肺炎和急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）等呼吸道相关临床特征［1-2］，但越来越多的研究发现 COVID-19 与静脉、动脉和微血管血栓形成的血栓前状态密切相关，这些血栓前状态也预示病人的不良预后［3-4］。而目前关于新冠病毒感染、血栓形成和临床结局之间的精确联系尚不清楚。因此，有关新冠病毒感染如何引起血栓前状态和血栓并发症、如何影响COVID-19 发病进程，以及如何进行有效防治等，均为基础与临床亟待解决的重大问题。本文将结合COVID-19 患者的血凝异常，探讨COVID-19 相关血栓形成的潜在机制，探索预防和治疗与COVID-19 相关血栓形成的有效方法，使大家认识到对COVID-19 患者进行抗凝治疗的重要性。

1 冠状病毒简介

自进入21 世纪以来，已发现3 种冠状病毒引起人类严重的呼吸系统传染病，包括SARS 冠状病毒、中东呼吸综合征（Middle Eastern respiratory syndrome，MERS）冠状病毒及新冠病毒。冠状病毒以多种动物为宿主，并且可以传播至人类及多种动物。目前认为SARS 冠状病毒和新冠病毒可能起源于蝙蝠［1］，而 MERS 冠状病毒的宿主可能是单峰骆驼［5］。研究表明，冠状病毒在人畜共患传播之前，必须在中间宿主中进行自然选择，以使其具有感染人类的能力［5］。目前，在马来亚穿山甲中已鉴定出与新冠病毒密切相关的冠状病毒［6］。

冠状病毒通过其跨膜刺突蛋白（spike protein，S蛋白）感染宿主细胞。S蛋白包含S1和S2亚基，其中S1 亚基负责与宿主细胞表面受体结合，S2 亚基辅助病毒和宿主细胞融合［7］。MERS冠状病毒的S蛋白结合人上皮细胞表达的二肽基肽酶4（dipeptidyl peptidase-4，DPP-4）［5］，新冠病毒和 SARS 冠状病毒的 S 蛋白以血管紧张素转换酶2（angiotensin-converting enzyme-2，ACE-2）为受体感染人内皮细胞［7-8］。与SARS 冠状病毒相比，新冠病毒S 蛋白的受体结合结构域具有全新的结构特征，即在S1和S2亚基的连接处存在多个弗林蛋白酶切割位点［7］。S 蛋白的切割可能对病毒的感染性及感染宿主的范围起着重要作用，其结构特征可能与COVID-19 相关血栓形成的临床特征相关［4，7］。

2 COVID-19相关血栓形成和凝血异常

研究表明，COVID-19 患者发生静脉、动脉和微血管血栓形成风险显著增加［3-4，7］。在 COVID-19 重症患者中，纤维蛋白原、D-二聚体和C 反应蛋白（C-reactive protein，CRP）等急性期反应蛋白的升高可能与COVID-19 相关血栓前状态有关［9-10］。这些急性期反应蛋白也与患者的不良临床预后相关。与普通患者相比，重症患者血浆中D-二聚体升高，而血浆D-二聚体正在作为COVID-19的预后标志物［11-13］。

2.1 COVID-19与静脉血栓形成 研究显示，COVID-19 患者发生静脉血栓栓塞（venous thromboembolism，VTE）的概率明显增加［14-15］。与其他病毒相关ARDS患者相比，新冠病毒相关ARDS患者发生肺栓塞的概率显著升高；且在具有肺栓塞并发症的COVID-19 重症患者中，VTE 的累积发生率约为 25%～49%［15-16］。尸检研究表明，VTE 可能是导致COVID-19 重症患者死亡的主要原因［17-18］。在生前未被诊断为VTE 的COVID-19 患者中，尸检却观察到大量深静脉血栓或肺栓塞，且大面积肺栓塞可能是导致超过30%患者死亡的直接原因［18］。以上研究证实了COVID-19 与静脉血栓形成之间的关系。

2.2 COVID-19 与动脉血栓形成 除VTE 发生率明显升高外，COVID-19 患者发生动脉血栓栓塞的概率也增加了［16-17］。有研究报告COVID-19住院患者发生急性缺血性卒中的概率介于3%～5%，值得关注的是COVID-19 增加了年轻人发生急性缺血性卒中的风险［19］。此外，急性心肌损伤也是 COVID-19 患者常见的并发症，影响高达20%到医院就诊的患者［20-21］。由于心肌损伤增加了COVID-19 的严重程度，因此，在COVID-19 患者中要优先控制潜在的心血管危险因素。

2.3 COVID-19 与微血管血栓形成 尸检研究报告显示，肺部微血管血栓形成是COVID-19 重症患者的并发症［22-23］。这个特征在其他冠状病毒疾病中也有报道，不过该特征在COVID-19 重症患者中尤为明显［24］。与流感患者相比，COVID-19 相关 ARDS 患者发生肺部微血管血栓的概率增加了9 倍［24］。除了可以预见的弥漫性肺泡损伤外，对COVID-19 相关ARDS 患者的尸检研究还观察到血小板-纤维蛋白血栓分布在小型肺血管中，其在尸检肺中的发生率大约为80%～100%［22-23］。在COVID-19 患者中，微血管血栓形成可能与弥散性血管内凝血（disseminated intravascular coagulation，DIC）并 发 症 相 关 ，因 为71.4%的COVID-19 死亡患者在生前具有DIC 并发症，而在COVID-19 生存患者中DIC 并发症的发生率只有 0.6%［12］。

3 COVID-19相关血栓形成的可能机制

虽然新冠病毒导致血栓形成的具体机制还未阐明，但结合COVID-19 患者的临床数据，目前认为新冠病毒可能通过诱导免疫血栓形成（immunothrombosis）增加 COVID-19 患者血栓并发症的发病风险［4］。当新冠病毒感染内皮细胞后，诱导感染的细胞发生焦亡，导致其释放病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）和损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs），并触发邻近细胞释放促炎细胞因子和趋化因子，上调表达血管性血友病因子（von Willebrand factor，VWF）和一些黏附分子［4］。上述因素通过固有免疫途径促进血小板和白细胞活化，并使其募集在炎症内皮细胞周围。COVID-19 重症患者具有较强的炎症反应，提示机体可能激活固有免疫反应［25］。目前已明确固有免疫反应与血栓形成密切相关，提示COVID-19 患者的血栓并发症与免疫血栓形成相关［4］。在免疫血栓形成过程中，病原入侵机体诱导的炎症反应使血小板和白细胞活化，而活化的血小板和中性粒细胞分别释放无机多聚磷酸（polyphosphate，PolyP）和中性粒细胞胞外杀菌网络（neutrophil extracellular traps，NETs）协同参与激活内源性凝血途径；与此同时，病原体激活的补体通过募集白细胞、活化血小板、上调表达组织因子和促炎细胞因子等而增强内源性凝血途径的激活。这些因素最终导致不受限制的凝血酶生成和血栓形成。下面我们将结合COVID-19 患者的临床发现，进一步探讨内皮细胞、白细胞、血小板和补体系统在COVID-19 相关免疫血栓形成中的可能作用。

3.1 内皮细胞损伤 由于新冠病毒S 蛋白的受体ACE-2 广泛表达于肺、血管、心脏、肾脏和小肠等多种组织器官的内皮细胞，所以新冠病毒可以感染人体多种组织［7］。新冠病毒感染内皮细胞诱导其发生焦亡，导致细胞内容物的释放；而邻近的内皮细胞通过模式识别受体，如Toll 样受体（Toll-like receptor，TLR），识别释放的PAMPs 和DAMPs，引起强烈的炎症反应，并释放促炎趋化因子和细胞因子，这些炎症因子将激活固有免疫途径［26］。现已发现新冠病毒的多个单链 RNA 片段可被 TLR-7 和 TLR-8 识别［27］。此外，临床数据还发现COVID-19 患者体内促炎因子水平升高，如白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）、单核细胞趋化蛋白 1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）、巨噬细胞炎症蛋白（macrophage inflammatory protein，MIP）等［25，28］。 这些促炎因子可以破坏内皮细胞的功能和完整性，导致内皮下VWF 的释放、黏附分子的上调表达及内皮细胞来源的细胞因子和趋化因子的生成，进而通过固有免疫途径促进血小板和白细胞的活化和募集［4，29］。尸检研究显示，COVID-19 患者的肺、肾和肠等器官的内皮细胞存在炎症和细胞死亡的组织学证据，这也证实了新冠病毒感染引起内皮细胞损伤［30］。此外，严重缺氧是COVID-19 患者的一个重要特征，缺氧会激活低氧诱导因子（hypoxia-inducible factor，HIF），活化的HIF 可上调内皮细胞组织因子的表达，并下调天然抗凝蛋白——蛋白S（protein S，PS）和组织因子途径抑制剂（tissue factor pathway inhibitor，TFPI）的表达［31］。以上结果表明新冠病毒在系统性促进血管内皮细胞功能障碍中发挥直接作用，是导致血栓前状态进而诱导血栓形成的重要机制之一。

3.2 血小板活化 血小板除参与止血作用外，还具有重要的免疫功能［32］，血小板上许多受体和粒状蛋白在固有免疫反应中发挥着重要作用。实际上，活化的血小板从其α 颗粒和致密颗粒中释放出许多趋化因子，包括C-X-C 基序趋化因子配体1（C-X-C motif chemokine ligand 1，CXCL1）、CXCL5、C-C 基序趋化因子配体3（C-C motif chemokine ligand 3，CCL3）、CCL7、血小板因子4（platelet factor 4，PF-4）、中性粒细胞活化肽 2（neutrophil-activating peptide 2，NAP-2）和RANTES（regulated on activation，normal T-cell expressed and secreted）等，这些趋化因子促进白细胞募集到血管内皮损伤或发炎部位［33］。活化的血小板表面表达的P-选择素与白细胞表达的P-选择素糖蛋白配体1（P-selectin glycoprotein ligand 1，PSGL-1）结合而束缚白细胞［34］。同时，血小板表达的糖蛋白Ib（glycoprotein Ib，GP-Ib）通过与白细胞表达的整合素Mac-1（macrophage antigen 1）结合［35］，协助白细胞与活化的血小板黏附，继而形成血小板-白细胞异聚体。该异聚体除了改变血小板和单核细胞的生物学功能外，还可促进微血管栓塞的形成［36］。此外，活化的血小板还通过释放PolyP 而促进血凝，后者通过活化XII 因子（factor XII，FXII）而驱动内源性凝血途径的凝血酶生成和血栓形成［37］。

目前有关新冠病毒与血小板的相关研究较深入的是对血小板数量的影响，而对于如何影响COVID-19 相关血栓形成的机制相对较少。在COVID-19 的重症患者中常见血小板减少症，但血小板减少的程度通常较轻，而在普通COVID-19 患者中，血小板减少症不常见［38］。

3.3 白细胞活化 炎症标志物（例如CRP、铁蛋白和IL-6）的升高是COVID-19 重症患者的显著特征之一［9］。与普通患者相比，COVID-19 重症患者产生IL-6的CD14+/CD16+单核细胞显著扩增［39］。促炎细胞因子（主要是IL-6）通过活化白细胞（主要是单核细胞和中性粒细胞）上调表达组织因子，增强凝血作用［40］。另一方面，活化的血小板促进中性粒细胞释放NETs。现有数据表明，COVID-19 患者血清中NETs 水平升高，且NETs 水平升高与D-二聚体升高相关，二者与疾病的严重程度相关［41］。活化的白细胞释放NETs 是一种固有免疫应答，是机体干扰病原体入侵的主要防御机制。研究表明，NETs 除可以隔离病毒外，还能捕获和杀死细菌和真菌［42］。在血栓形成的条件下，带负电荷的NETs 可以捕获红细胞并激活血小板；NETs 还可以作为凝血的支架和强力激活剂，通过活化FXII 激活内源性凝血途径［43］。现有结果表明NETs 通过激活血小板和FXII 可能在介导COVID-19相关血栓形成中发挥重要作用。

3.4 补体系统的活化 补体系统是固有免疫系统的重要组成部分。在COVID-19 重症患者的活检组织中发现补体成分C5b-9 和C4d 在微血管中广泛沉积，且这些血管主要表现为微血管血栓［44］。另外，COVID-19 重症患者的肺切片均表现出很强的补体染色，同时重症患者的血清中C5a 水平升高，在一些病例中还发现新冠病毒的S 蛋白与C5b-9 和C4d 共定位［4，44］。从机制上讲，新冠病毒的核衣壳蛋白与甘露糖相关丝氨酸蛋白酶2（mannose-associated serine protease-2，MASP-2）结合可能触发补体系统激活并放大组织损伤［4］。激活补体途径将增强内皮细胞促炎因子的表达，并上调表达一些内皮黏附分子。其中，C5a 和C3a 能促进单核细胞和中性粒细胞的募集和活化。通过C5a 诱导中性粒细胞组织因子的表达、C5b-7 诱导单核细胞组织因子的表达和C5b-8/C5b-9介导的血小板激活，补体系统的活化也可以直接诱导促血栓表型［45］。此外，CRP 是补体途径的激活剂，血浆CRP水平升高与COVID-19严重程度的相关性也说明了免疫系统和补体系统之间的联系［9］。

4 靶向血栓形成——中西医防治COVID-19 的探索

由于COVID-19 患者血栓并发症发生率较高，所以临床上正在探索抗血栓治疗对COVID-19 患者的防治效果。目前，一些具有抗炎和（或）抗病毒特性的抗血栓药物已经进入临床试验。此外，血栓形成可以归属中医“血瘀”病机范畴，一些具有活血化瘀功效的方剂也纳入了我国COVID-19 防治指南。本文主要从以下几个方面讨论中西医通过靶向血栓形成而防治COVID-19的探索。

4.1 抗凝治疗 针对COVID-19 患者的血栓并发症，目前临床上一般采用低分子肝素或普通肝素对VTE 进行预防治疗［13，46］。在 D-二聚体升高或脓毒症诱导的凝血功能评分升高的COVID-19 患者中，使用低分子肝素治疗可降低死亡率［47］。除了具有直接抗凝作用外，肝素还可能通过结合DAMPs、促炎细胞因子甚至病毒颗粒而发挥抗炎和抗血栓作用［48］。早期的体外实验显示，肝素可抑制SARS冠状病毒与细胞的结合，其机制可能是通过肝素抑制FXa 的活性从而抑制病毒感染细胞，因为研究发现FXa 可通过切割SARS 冠状病毒的S 蛋白使病毒更有效地感染细胞［49-50］；近期发现肝素可以直接与新冠病毒的S 蛋白结合［51］。这些结果提示肝素可能具有抗新冠病毒特性。需要注意的是肝素治疗可能导致肝素诱导的血小板减少症，不过，目前观察到肝素诱导的血小板减少症仅限于个别病例报告［4］。

4.2 靶向接触因子FXII FXII 可以被携带负电荷的NETs 或血小板来源的PolyP 激活而导致血栓形成。FXIIa 通过释放缓激肽、上调中性粒细胞功能和生成单核细胞来源的促炎细胞因子，发挥促炎功能，进而促进血栓前状态。在血栓形成动物模型中，抑制FXIIa可以防止闭塞性血栓形成，且不妨碍止血功能［52］。在系统炎症反应综合征动物模型中，使用致命的大肠杆菌进行挑战实验，显示抑制FXIIa可提高动物的生存率，并减少补体激活、中性粒细胞脱颗粒和包括IL-6 在内的许多炎症标志物的产生［53］。由于FXII 活性缺乏的个体未见出血表型，其抑制剂用于治疗血栓是相对安全的，所以FXII 是一个有吸引力的、治疗COVID-19的靶点［4，54］。

4.3 纤溶治疗 组织型纤溶酶原激活剂（tissuetype plasminogen activator，t-PA）将无活性的纤溶酶原转化为有活性的纤溶酶，后者通过分解交联的纤维蛋白，达到溶栓的效果。目前一些研究正在探索t-PA 在治疗COVID-19 中的潜在价值，因为COVID-19重症患者常出现ARDS，进而导致大量纤维蛋白形成和微血管血栓形成。在一项针对ARDS 的临床研究中，1 例COVID-19 重症患者在t-PA 输注期间改善了氧合功能，但这种效果在t-PA 治疗停止后消失［55］。由于t-PA 可能增加严重出血风险，这使人们考虑采用雾化疗法以增加其局部浓度，并减少其对全身凝血的效应。在严重的ARDS 患者中，使用雾化纤溶疗法可以改善患者氧合作用和通气参数［56］，因此该疗法可能是治疗COVID-19的一种可行方案。

4.4 抗血小板治疗 研究表明，抗血小板治疗可以降低脓毒症的死亡率，但数据大多来自药物阿司匹林［57］。在一种细菌性败血症的小鼠模型中，阿司匹林可预防DIC 和中性粒细胞介导的微血管血栓形成［58］。不过，阿司匹林在治疗 COVID-19 中的作用尚待研究。目前有研究正在评估具有抗血小板作用的药物在降低COVID-19 严重性方面的潜在作用，包括双嘧达莫和萘莫司他。有研究报道，双嘧达莫可在体外抑制新冠病毒的复制，临床数据也表明双嘧达莫可改善COVID-19 重型患者的临床过程［59］。萘莫司他是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，用于治疗DIC 和胰腺炎，研究显示萘莫司他具有阻断MERS 冠状病毒和新冠病毒在体外感染肺细胞的能力［60］，其用于治疗COVID-19的作用正在评估［61-62］。

4.5 中医活血化瘀治疗 国家卫健委COVID-19 诊疗方案（试行第五至七版）推荐应用血必清注射液用于COVID-19 重型和危重型的临床治疗［63］。血必清注射液是以古方血府逐瘀汤为基础精炼出的静脉制剂，有效成分包括红花黄素A、阿魏酸、丹参素、芍药苷、原儿茶醛、川芎嗪等，具有活血化瘀、疏通经络、清热解毒等功效［63-64］。血必净注射液可以从内源或（和）外源性凝血途径、促纤溶系统等方面有效纠正凝血系统紊乱，降低D-二聚体水平［63-64］。另一方面，血必清还可抑制内源性IL-6 的释放，保护微血管内皮细胞，抑制免疫血栓形成，从而改善凝血功能异常［63］。此外，诸多中医专家认为活血化瘀疗法是SARS 的重要治法，并强调SARS 早期使用活血化瘀药干预的积极作用［65］。在临床实践中，SARS 患者在接受了含丹参酚酸B 的复方丹参注射液或以单味丹参为主药的方剂治疗后，胸闷、憋气症状有所缓解［65］。因此，在SARS中灵活运用活血化瘀的用药思想，可以为COVID-19诊疗方案提供新的方向。

5 结语

新冠病毒的出现以及随之而来的全球大流行，给医疗卫生和经济带来了前所未有的挑战。血栓前状态是COVID-19 重症患者的关键临床特征，它与动脉、静脉和微血管血栓的高发生率，以及不良的临床预后有关。数据表明，新冠病毒可能通过诱导免疫血栓形成增加患者血栓并发症的发病风险。免疫血栓形成理论认为：新冠病毒感染内皮细胞，诱导炎症反应，激活机体固有免疫途径，导致血小板和白细胞活化、NETs 生成、补体系统活化等结果，这些因素促使了COVID-19 重症患者的血栓前状态，并可能导致严重的血栓并发症。本文通过分析炎症、免疫和血栓形成之间的相互关系，旨在提高人们对COVID-19患者血栓并发症的认识和了解，有助于更早地诊断和发现血栓事件，以便及早采用抗血栓治疗（中医活血化瘀治疗）而改善COVID-19患者的预后。