肿瘤酸性微环境对免疫细胞影响的研究进展①

杨 鹏 孙 莹 王志宏 郑源强 陈国江④ 石艳春内蒙古医科大学内蒙古自治区分子生物学重点实验室呼和浩特010058

癌症具有高度异质性,随着肿瘤的发展它会变成由多种细胞组成的复杂“器官”。肿瘤细胞和非肿瘤细胞之间的相互作用形成肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)。TME是由肿瘤局部的细胞和非细胞成分组成。在细胞成分中,除了肿瘤细胞外,还有基质细胞,内皮细胞和其他血管细胞以及各种类型的免疫和炎症细胞组成[1]。在能量代谢失调,血液灌注不足和增殖失控的情况下,TME的非细胞组成不同于正常组织,TME中的特征包括酸化,缺氧,血糖浓度降低和分泌蛋白质的变化[2]。TME在肿瘤的发生、发展、转移、复发和耐药中起着不可或缺的作用。肿瘤浸润的免疫细胞代表一把双刃剑,因为它们可以支持或抑制肿瘤的生长。利用好免疫细胞,对于治疗肿瘤有着重要的意义。

1 TME与酸化

肿瘤酸性微环境,从本质上来说是肿瘤细胞的异常代谢作用下的结果之一,同时也是免疫抑制微环境的关键因素[3]。实体瘤的显著特征是存在酸性的TME,这是由于生长中的肿瘤细胞具有独特的代谢现象,使它们能够通过有氧糖酵解优先利用葡萄糖,这被称为“Warburg效应”[4]。葡萄糖被代谢为乳酸,后者通过单羧酸盐将转运蛋白(monocarboxylate transporters,MCTs),MCT-1和MCT-4与质子共同转运,从肿瘤细胞中输出,导致乳酸积累,降低了TME的pH从而造成大量乳酸堆积,引起TME pH降低[5]。此外,TME中乳酸浓度的增加对某些肿瘤是有利的,因为乳酸可以转化为丙酮酸,从而为三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle,TCA cycle)提供动力。因此,可以为异质性肿瘤中的邻近细胞提供燃料,同时抑制免疫反应[6-7]。除乳酸外,由氧化代谢产生的CO2水平升高也是肿瘤酸性的另一主要来源,CO2在缺氧条件下通过TCA循环和戊糖磷酸途径产生,可通过碳酸酐酶(carbonic anhydrase,CA)被水合,并转换成HCO3-和H+,碳酸氢盐将转运蛋白HCO3-转运回肿瘤细胞内,细胞外H+浓度升高,pH下降。生长中的肿瘤细胞还有一个重要的特征,就是低氧。缺氧信号传导的关键介质是缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor,HIF)[8]。缺氧会激活HIF途径,进而上调葡萄糖转运蛋白和CA-IX,导致肿瘤酸化的进一步加重低氧也可以上调MCTs,促进微环境的酸化[9-10]。

因此,从微酸环境的形成来看,导致酸化的化学成分是不同的,一种是乳酸性酸化,另外一种是碳酸性酸化。TME的酸化,对于免疫细胞的影响机制,也存在乳酸与单独酸化(提高H+浓度)的区别。

2 免疫细胞对p H的感知

目前研究认为,免疫细胞可以通过细胞表面的pH敏感型受体去识别和响应细胞外的H+[11]。免疫细胞广泛表达G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs),包括GPR68(OGR1),GPR65(TDAG8),GPR4和GPR132(G2A)。它们可作为溶脂蛋白的受体,可通过细胞外结构域中的组氨酸残基(PH6.4～6.8)的咪唑侧链的质子化来激活。这些受体由不同的信号传导机制来介导,主要有PLC/Ca2+信号传导通路,腺苷酸环化酶(adenylyl cyclase)的刺激介导的cAMP合成与累积和蛋白激酶A/ERK介导的信号传导通路[12-14]。酸敏感离子通道(acid-sensing ion channels,ASICs)代表了第二组被质子激活的受体[15]。它们是涉及疼痛知觉,缺血性中风,机械感觉,学习和记忆的阳离子选择性离子通道。ASICs主要包括在周围感觉和中枢神经系统神经元中表达的六个同工型(ASIC1a,ASIC1b,ASIC2a,ASIC2b,ASIC3和ASIC4)免疫细胞中ASIC的表达尚未明确定义[16]。有研究显示,这些受体在单核细胞,巨噬细胞和树突状细胞中表达[17-19]。质子受体的第三个家族包括瞬时受体电位香草酸亚型1(TRPV1)[20]。其最初与感觉神经元相关联,TRPV1已经证实在免疫细胞中表达,被发现在先天免疫系统和适应性免疫系统的细胞中表达,包括巨噬细胞、树突状细胞、T淋巴细胞及NK细胞[21]。TRPV1在免疫细胞中,既参与钙信号传导,又参与外部刺激(例如温度或pH)的传导。Ca2+作为第二信使,其在免疫细胞中的活化,分化,增殖,细胞因子分泌和效应功能起到一定的作用[22]。还有一组重要的受体是MCTs,已经报道了MCT-1,MCT-2和MCT-4在免疫细胞中的表达,包括人粒细胞,淋巴细胞和单核细胞[23]。

总的来说,当免疫细胞处于低pH环境时,抗肿瘤效应细胞(如T细胞和NK细胞)趋于功能丧失,并经历可逆的无反应状态,随后发生凋亡。相反,免疫抑制成分,例如肿瘤相关巨噬细胞,髓样来源抑制细胞和调节性T细胞通过肿瘤酸度参与并维持肿瘤生长,同时阻断抗肿瘤免疫反应[24]。

2.1 树突状细胞 树突状细胞(dendritic cells,DCs)在肿瘤免疫中,主要发挥抗肿瘤作用[25]。DCs的成熟代表了生命周期中的关键一步,使它们获得了完整的抗原提呈细胞(antigen presenting cells,APC)功能。当通过模式受体(pattern recognition receptors,PRR)与危险相关的分子模式(dangerassociated molecular patterns,DAMP)时,将启动成熟,其中不同的DC亚组表达不同的PRR,从而进一步促进了其功能水平。一旦成熟,DCs上调它们的抗原呈递和共刺激分子,转化自己变成有效的T细胞激活剂,因此连接先天和适应性免疫[26]。

有一项关于癌症免疫逃逸机制的研究表明,在多细胞肿瘤球体中存在IL-4和GM-CSF的情况下培养的单核细胞不会获得CD1a表达(单核细胞衍生DC的标志物),并降低产生IL-12的能力。已证明这些免疫抑制作用是由肿瘤细胞产生乳酸诱导的,而不是HCl。在乳酸浓度大于10 mmol/L时,将pH调至中性,只能部分恢复功能,可能还涉及与MCT-1转运系统无关的其他机制[27]。最近有研究证明,乳酸强烈抑制CD1a+DC的分化。在中性pH下,乳酸盐降低CD1a+CD14-DC分化的抑制作用,而IL-12仍然受抑制。单独的pH改变影响分化标志物或细胞因子的表达水平。因此,乳酸和低pH值一起存在时会提供有效的DC调节信号,这可能是MCT作用的结果[28]。已有研究证明ASICs参与了酸化诱导的DC成熟[29]。

2.2 肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAM) TAM是TME的重要组成部分,能够促进癌症进展。TME中过量乳酸的酸化作用会增加巨噬细胞中的精氨酸酶I(arginase I,ARG1)表达,从而抑制T细胞的增殖和活化。二氯乙酸盐(dichloroacetate,DCA)是一种丙酮酸脱氢酶激酶的抑制剂,可靶向抑制巨噬细胞产生ARG1。乳酸预处理的巨噬细胞抑制CD8+T细胞增殖,但用乳酸和DCA预处理巨噬细胞后,CD8+T细胞增殖得以恢复[30]。TNFα和豆蔻佛波醇乙酯(phorbol myristate acetate,PMA)诱导了原代人单核细胞和人急性单核细胞白血病停代细胞(mono mac6,MM6)细胞系中OGR1(GPR68)的表达[31]。已经有研究证明,乳酸激活巨噬细胞表面的Gpr132(G2A)受体,促进巨噬细胞的M2极化。并且证明敲除荷瘤小鼠GPR132基因后,乳腺癌转移被抑制。该研究还表明,是乳酸而不是H+激发了上述的效应[32]。乳酸通过ERK/STAT3通路驱动巨噬细胞M2极化以促进乳腺癌的增殖,迁移和血管生成[33]。对于酸性pH调节巨噬细胞的极化作用,最近研究表明,是由GPCR和cAMP介导,已证明由肿瘤酸化诱导的GPCR信号的激活可增加转录因子诱导的cAMP早期阻遏物(incducible cAMP early repressor,ICER)的表达,反过来刺激巨噬细胞向非炎症M2表型极化,从而促进体内肿瘤成长[34]。乳酸通过极化M2巨噬细胞,一方面抑制了浸润在肿瘤环境的抗肿瘤效应细胞,另一方面增强肿瘤的增殖,迁移和侵袭。

2.3 NK细胞(natural killer cells,NK) NK细胞在抗肿瘤免疫中起着重要作用。人们普遍认为TME的酸化会抑制NK细胞的抗肿瘤活性。已发现乳酸和低pH值会降低NK细胞的细胞毒性,乳酸处理的NK细胞表面NKp46的表达降低。并且证明肿瘤来源的乳酸可直接抑制NK细胞功能,也可以通过增加抑制NK细胞毒性的髓样来源的抑制细胞(myeloid-derived suppressor cell,MDSC)数量来间接抑制NK细胞功能[35]。在C57BL/6小鼠中,乳酸抑制NK细胞IFN-γ和颗粒酶B的产生[36]。在PMA/Ionomycin刺激下,NK细胞暴露于乳酸可阻断其IFN-γ的产生,研究还表明,鼠NK细胞摄取乳酸会导致细胞内酸化和能量代谢受损[36]。在大肠癌肝转移的肿瘤中发现,浸润的NK细胞数量明显减少,并且验证了NK细胞的凋亡。在用乳酸处理NK细胞时,TME中的乳酸引起pH依赖性线粒体应激和代谢功能障碍,从而促进细胞凋亡。由于MCT的阻断没有改善NK细胞凋亡,因此乳酸的作用可能只与TME的pH有关[37]。

2.4 T细胞 浸润在TME的T细胞在控制肿瘤发展中起积极作用,也有调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs)促进免疫抑制。已经有体外实验证明,乳酸对人细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)表现出较强的抑制作用,细胞因子(IL-2和IFN-γ),细胞毒性(颗粒酶B和穿孔素的分泌)和细胞增殖均被明显抑制,并且pH恢复后CTL功能恢复。值得注意的是,单独加乳酸盐没有影响,HCl可以轻度抑制细胞因子的分泌。还有一点,此研究中T细胞培养基pH降低后的胞内pH也降低,可能与MCT有关[38]。最近有实验表明,用乳酸处理CTL后,TCR触发JNK,c-Jun,p38和NFAT的磷酸化受阻,导致CTL功能抑制[36,39]。抗CD3抗CD28刺激的小鼠脾细胞,表面受体TDAG8激活后,IL-2的产生受到抑制[40]。在pH 6.5的酸性环境中,黑色素瘤患者的肿瘤浸润T细胞反应性下降,TCR成分(如CD3ζ链)的表达降低,IL-2,TNF-α和IFN-γ的分泌受损,当pH恢复时T细胞状态逆转[41]。目前有研究表明,小鼠T细胞外pH降低,对细胞内pH没有影响,并且证明T细胞表达ASIC3,ASIC4OGR1和TDAG8。研究还显示,IFN-γ的调节,可能受TDAG8介导的cAMP通路调控,但是单独敲除TDAG8并不能缓解pH降低带来的抑制。目前还需要对该受体和其他酸敏感受体进行研究,以确定单独抑制或联合抑制是否可有效缓解pH降低下的表型[42]。根据对之前研究的总结,乳酸可能是主要的影响因素。最近有研究指出,阻断T细胞的MCT,不会影响T细胞的功能[43]。这为MCT抑制剂的使用,提供了依据。当然也有一种观点,高浓度的乳酸和H+阻断T细胞的MCT,影响T细胞的糖酵解,进而影响TCR的激活[44]。对于乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase A,LDHA)的抑制,也有报道,CD4+T细胞中LDHA抑制会导致IFN-γ产生出现缺陷[45]。LDHA负责将丙酮酸转化为乳酸,在肿瘤细胞中高度表达,虽然抑制LDHA可以降低乳酸浓度,但是对T细胞效能有影响。

另一方面肿瘤相关的成纤维细胞(cancerassociated fibroblasts,CAFs)产生的乳酸通过SIRT1介导的T-bet降解,降低抗肿瘤Th1亚型的百分比。并通过在前列腺癌模型中促进FoxP3激活来刺激Treg增殖,诱导免疫抑制环境[46]。

3 靶向肿瘤酸性微环境以改善癌症免疫治疗

肿瘤酸性微环境抑制T细胞和NK细胞功能,从而抑制肿瘤免疫监测。因此可以控制TME酸度从而校正T细胞功能障碍和增强T细胞效能。目前,主要有两种降低TME pH的方法,一种是单独降低H+的浓度,另外一种是降低乳酸的浓度。单独降低H+是比较直接的方法,通过中和H+,使用质子泵抑制剂,抑制质子转运和碳酸酐酶[42,47-48]。而降低乳酸浓度的方法则有多种,比如①通过敲除肿瘤细胞糖酵解基因,抑制糖酵解源头；②通过阻断乳酸转运蛋白MCT1和MCT4,阻止乳酸向肿瘤细胞外转运[43]。最近有研究显示,限制肿瘤细胞糖酵解既保留了T细胞的效应功能,又增强了检查点疗法[43]。因此联合其他免疫疗法,可能是更有前景的策略。针对实体瘤的CAR-T(chimeric antigen receptor T cells)和CAR-NK(chimeric antigen receptor NK cells)技术,目前面临着免疫抑制的困境[49-50]。在此技术之上,增加肿瘤浸润的T细胞的数量和提高抵抗酸性微环境的能力,是未来改善CAR-T/CAR-NK治疗实体瘤疗效的策略之一。

GPCRs中的OGR1(GPR68)在多种免疫细胞中表达,特别是在巨噬细胞和T细胞中的大量表达。因此,GPR68信号传导可能会影响肿瘤中的免疫细胞功能。GPR68可能是未来肿瘤治疗重要的靶点[51]。

4 总结

总之,主要通过体外实验分析低pH对免疫细胞功能的影响。一些矛盾的结果主要反映出降低培养基pH值的不同方法,一些研究使用了HCl的等渗溶液,但另一些研究则使用了乳酸。因此,通过使用HCl或乳酸来改变培养基的pH来发现不同的观察结果并不意外。那些同时研究了这两种化合物的研究都支持低pH值本身会发挥主要的免疫调节作用,进一步支持了乳酸介导的观点。目前为止,肿瘤酸性微环境对免疫细胞造成的影响已经明晰,但是其受到酸化抑制的机制还需要继续研究。