T细胞耗竭机制的研究进展①

刘 宁 徐 屹 段丁瑜

(口腔疾病研究国家重点实验室,国家口腔疾病临床研究中心,四川大学，成都 610041)

机体受抗原入侵感染后，抗原特异性初始T细胞活化,分化成效应T细胞和记忆T细胞。细胞分化过程伴随细胞的快速增殖、转录、表观遗传及代谢活性重编程,并获得效应T细胞的基本功能,包括细胞增殖及迁移能力的增强。效应T细胞在活化扩增、清除抗原、控制炎症反应及感染后大部分死亡,小部分转为记忆性T细胞长期存在。初始T细胞活化和分化是紧密协调的过程,取决于与抗原呈递细胞相互作用的特征、抗原刺激的持续时间、T细胞受体(T cell receptor,TCR)信号传导的强度和微环境[1]。在急性感染清除后,记忆T细胞具有很多不同于初始T细胞和效应T细胞或其他T细胞亚群的性质,包括再次遇到抗原后重新激活效应功能、高增殖潜能和在没有抗原刺激的情况下通过白细胞介素7(interleukin 7，IL-7)和IL-15驱动的稳态增殖能力。这些特性随着感染时间的推移逐渐获得,并使T细胞能够行使保护性免疫功能[2]。然而,在一些慢性感染过程中,抗原特异性T细胞虽然最初获得了相应的效应功能,但随着抗原刺激的长时间持续,这些效应功能逐渐减弱至丧失,无法转换成非抗原依赖性记忆T细胞,这种功能障碍状态代表了一种T细胞独特的分化状态,称为T细胞耗竭[3]。T细胞耗竭的状态通常表现为以下几个特征：①效应功能的逐步缺失;②多种抑制性受体持续上调和共表达;③关键转录因子的表达和功能发生改变;④免疫代谢紊乱,耗竭的T细胞无法转化为非抗原依赖性记忆T细胞[4]。1998年,GALLIOMRE等[5]和ZAJAC等[6]在小鼠慢性病毒感染的研究中将T细胞耗竭描述为病毒慢性感染期间抗原特异性T细胞的功能障碍。 从那以后,T细胞耗竭在多种动物模型和人类慢性病毒、细菌、寄生虫感染以及癌症中得到证实[7]。近年来T细胞的耗竭机制及耗竭状态的逆转已经成为慢性感染、肿瘤及自身免疫性疾病等多个领域的研究热点。

研究表明,持续性的慢性感染如结核分歧杆菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)感染、布鲁杆菌感染等可诱导T细胞进入耗竭状态,以逃避宿主免疫机制。慢性牙周炎是口腔内最常见的持续性的慢性感染,多种牙周致病菌通过不同的方式抑制或逃避宿主防御功能,如产生降解IgA和IgG的酶,抑制白细胞的吞噬功能,侵入牙龈上皮细胞并增殖以躲避宿主防御机制,导致感染慢性化,疾病迁延不愈。既往研究表明，在慢性牙周炎中T细胞耗竭相关标志分子存在变化,因此,本文对T细胞耗竭的机制和研究现状进行综述,并总结和展望其与慢性牙周炎发生发展可能的联系,为相关研究提供新的切入点和新思路。

1 耗竭T细胞的特征

1.1功能障碍和功能丧失 在效应功能方面,耗竭T细胞会出现逐步渐进的功能障碍和功能丧失。通常,产生IL-2、高增殖能力和离体杀伤等功能首先丧失,其他功能如产生肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)的能力往往在功能障碍的中间阶段丧失。严重耗竭最终会导致T细胞部分或在某些情况下完全缺乏产生大量IFN-γ、β-趋化因子或脱颗粒的能力。耗竭的最后阶段是T细胞的消失[2]。

1.2抑制性受体的表达 抑制性受体的持续性表达上调和多种抑制性受体的共表达是耗竭T细胞在慢性感染或肿瘤免疫应答过程中的重要特点。最先发现的抑制性受体是CD28家族的跨膜蛋白受体：程序性死亡受体-1(programmed cell death 1,PD-1),其两种已知的配体是PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)[8]。PD-1/PD-L1免疫检查点在外周组织中起作用并且充当T细胞的负调节剂以帮助控制局部炎症反应并维持自身耐受性[9]。 FREEMAN等[10]研究发现PD-L1信号传导可以抑制TCR介导的T细胞增殖。PD-1-PD-L1相互作用会下调CD3/CD28 T细胞对抗原刺激的反应能力。而后,BARBER等[11]对淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus,LCMV)慢性感染期间病毒特异性CD8+T细胞的基因表达谱进行分析后发现,功能耗竭的CD8+T细胞的PD-1 表达上调,并且体内施用抗体阻断该抑制性受体与其配体PD-L1的相互作用可以改善耗竭T细胞的效应功能。随后发现在其他持续性病毒、非病毒感染以及癌症中，PD-1途径在抑制抗原特异性T细胞的有效性方面也具有重要作用[7,12]。 另一CD28家族成员T 细胞杀伤相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4,CTLA-4)也被发现与T细胞耗竭相关。研究显示,机体感染人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)或丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)后,CTLA-4的高表达可以影响T细胞应答功能的质量[13-15]。此外,在HIV、HCV和LCMV感染期间,T细胞表达T细胞免疫球蛋白及黏蛋白分子-3(T-cell immunoglobulin domain and mucin domain-3,Tim-3)的频率和水平与细胞耗竭状态和感染严重程度呈正相关[16-18]。除了上述几种抑制性受体之外,越来越多的研究将B和T淋巴细胞衰减因子(B and T lymphocyte attenuator，BTLA)、CD160和CD244等抑制性受体的表达与慢性感染、自身免疫性疾病(如系统性红斑狼疮)及某些癌症(如胸腺瘤、肺癌)中的T细胞耗竭现象联系起来[19]。

在LCMV慢性感染过程中,研究者发现在相同的病毒特异性CD8+T细胞上存在多种抑制性受体的大量共表达,且抑制性受体共表达的程度与感染的严重程度相关[3]。共表达Tim-3和PD-1(Tim3+PD1+)的CD8+T细胞比仅表达PD-1(Tim3-PD1+)的CD8+T细胞表现出更严重的耗竭现象。与仅阻断其中任一途径相比,同时对Tim-3和PD-1途径进行体内阻断在恢复T细胞的抗病毒免疫和病毒控制方面具有协同效应[20]。此外,在感染边缘虫的牛体内也发现了PD-1和淋巴细胞活化基因3( lymphocyte activation gene 3,LAG-3)的共表达，且两种受体的共表达可促进T细胞耗竭[21]。这些研究提示多种抑制性受体可共同表达,并且在T细胞耗竭过程中可能起协同作用。

1.3表观遗传学特点的改变 T细胞发生耗竭后也会表现出转录谱及染色质的广泛改变。一些转录因子如NR4A、T-bet、 Eomes、Blimp-1、NFAT、 BATF 和 VHL虽然也在正常效应T细胞内发挥作用,但在耗竭T细胞内的功能却不同于其他T细胞亚群[22]。比如近期研究发现NR4A是诱导T细胞耗竭的关键调节因子[23-24]。耗竭CD8+T细胞缺少几个存在于正常效应T细胞和记忆T细胞fng基因座上的开放染色质区域(chromatin accessible region,ChAR),然而却检测到耗竭CD8+T细胞的特异性ChAR,该区域位于编码PD-1的Pdcd1基因的上游23.8 kb碱基处,在该区域发现了调节基因表达的转录因子(RAR,T-bet和Sox3)的潜在结合位点。当这些转录因子结合位点发生突变后,淋巴细胞的PD-1表达受到抑制。这表明 -23.8 kb ChAR 存在于耗竭T细胞但不存在于正常T细胞中,并作为增强子维持耗竭CD8+T细胞PD-1的高表达[25-26]。相关领域有待进一步研究，以为慢性感染性疾病的防治提供新思路。

2 T细胞耗竭发生发展的相关因素

2.1抗原刺激水平和持续时间 抗原水平和抗原持续刺激时间是诱导T细胞耗竭的重要因素。在小鼠中发现,持续抗原呈递直接驱动慢性病毒感染期间的T细胞耗竭[27]。小鼠感染LCMV慢性株后,如果早期(感染后大约1周)将CD8+T细胞从持续抗原刺激中分离出来,则这些细胞可分化成功能完全的CD8+记忆T细胞。然而，如果这些T细胞暴露于持续存在的抗原2～4周,T细胞耗竭变得确立,这些细胞则不能简单地通过从抗原暴露中移除而恢复正常记忆分化[28-29]。持久痰抗酸阳性空洞型肺结核患者体内大量结核分枝杆菌持续感染也可能引起T细胞功能耗竭的发生[30]。此外,慢性抗原刺激还通过转录因子NFAT导致PD-1的持续表达[31]。 上述研究表明慢性抗原刺激、感染的水平以及持续时间可能是导致T细胞耗竭的关键因素,并且与慢性感染期间功能障碍的严重程度相关。

2.2CD4+T细胞及NK细胞 在慢性感染中,CD4+T细胞对调节CD8+T细胞的应答起重要作用。CD4+T细胞通过CD40和CD40配体相互作用激活专职抗原呈递细胞如树突状细胞,分泌趋化因子和细胞因子,其将初始T细胞引导至次级淋巴器官中并激活,诱导T细胞至感染部位,同时CD4+T细胞产生的细胞因子,包括IL-2和IL-21,可直接作用于CD8+T细胞[32]。病毒慢性感染的小鼠体内CD8+T细胞初次免疫应答时，CD4+T细胞的短时缺失可以导致CD8+T细胞出现严重耗竭和高病毒载量[33]。在LCMV小鼠的研究中发现,初始和抗原特异性效应CD4+T细胞的有效辅助作用可逆转体内已经出现耗竭现象的CD8+T细胞[34]。近期研究发现，感染引起免疫反应的初期CD4+T细胞通过诱导对记忆性T细胞回忆反应来限制T细胞的耗竭[35]。此外,CD8+T细胞耗竭状态也受到NK细胞的影响,NK细胞可通过直接杀伤限制APC的活化能力,产生免疫调节性细胞因子如IL-10,以及剔除有助于应答的CD4+T细胞等方式来抑制抗病毒CD8+T细胞的免疫功能[36-37]。

2.3可溶性细胞因子和抑制性受体 可溶性细胞因子如IL-10和TGF-β也影响T细胞的免疫功能状态。IL-10是一种可减弱炎症反应的免疫调节细胞因子[38]。研究发现,IL-10在几种病毒持续感染期间(包括EBV、HBV、HCV、HIV和LCMV)表达水平上调。而IL-10的阻断可增强病毒控制并改善耗竭T细胞的应答。提示IL-10在限制免疫介导的病毒控制和T细胞耗竭发展中发挥作用[2,22]。TGF-β通过影响多种免疫细胞谱系的增殖、分化和存活来控制免疫应答并维持免疫稳态[38]。病毒特异性CD8+T细胞中指示TGF-β信号传导的信号转导物Smad2在慢性LCMV感染中的磷酸化比在控制良好的感染期中更强[39]。而阻断T细胞接受TGF-β信号的通路可改善慢性LCMV感染期间CD8+T细胞的功能,并防止CD8+T严重耗竭和某些CD8+T细胞特异性的缺失[39]。在肿瘤微环境中也发现IL-10和TGF-β的存在可以抑制T细胞的功能[38]。

与细胞因子相似,抑制性受体也影响慢性感染及肿瘤中T细胞的功能及状态。耗竭CD8+T细胞表达多种抑制性受体,抑制性受体共表达的模式影响慢性感染期间这些T细胞的功能质量，且慢性感染的严重程度与表达的抑制性受体的数量和强度相关[3]。抑制性受体可以在几个水平上抑制T细胞功能：与共刺激受体竞争结合共享配体或干扰形成微团聚体和脂筏;干扰共激活TCR;上调参与T细胞功能障碍的基因[19]。

耗竭T细胞的发生和发展是一个多种因素相互影响的复杂过程。CD4+T细胞、NK细胞、B细胞或细胞因子应答等任何方面的改变都可能导致机体对感染或肿瘤的有效控制变差,由此导致更高的抗原载量,从而进一步推动耗竭状态的发展。而每种影响因素对耗竭T细胞发生与发展产生影响的具体作用机制有待于进一步研究。

3 耗竭T细胞功能状态的逆转。

3.1逆转耗竭T细胞功能状态的方法 耗竭T细胞虽然表现出免疫功能障碍,对慢性感染和肿瘤细胞会失去有效控制,但T细胞耗竭并不是不可逆的终末状态。目前大量实验及临床研究显示通过阻断抑制性受体、阻断抑制性细胞因子或基因靶向疗法等方法均可以在一定程度上改善T细胞的功能状态,提高对病毒、肿瘤细胞及细菌的清除率。

PD-1的治疗性阻断通过重新编码代谢过程、促进增殖和上调效应分子的表达来重新激活耗竭T细胞的免疫反应[4]。在肿瘤微环境的研究中发现,抗PD-L1的治疗性阻断可重新激活及改善部分耗竭CD8+T细胞的代谢功能[40]。慢性病毒感染相关研究中发现,在T细胞耗竭发生后施用抗PD-L1或抗PD-1阻断抗体可提高CD8+T细胞增殖能力,增加细胞因子产生和增强细胞溶解活性并减少病毒载量[11]。此外,在实验性肿瘤模型中,抗CTLA-4或抗PD-1抗体可以增强耗竭CD8+T细胞的糖酵解能力和效应功能[40]。除了阻断单一的抑制性受体,近年来研究也发现Tim-3、LAG-3或TIGIT与PD-1途径同时阻断对逆转T细胞耗竭具有协同作用,可以更有效地改善T细胞功能并有助于病毒和肿瘤细胞的清除[21,41-42]。从免疫疗法的角度来看,调节细胞因子对耗竭CD8+T细胞的作用也是改善慢性感染和癌症期间生物学结果的有前景的治疗方法。 例如，IL-2给药在1992年被批准用于治疗转移性肾癌,并且在证明IL-2治疗在这些疾病中有一定功效后于1998年用于转移性黑素瘤,而阻断IL-10受体也可以改善病毒控制并减少T细胞耗竭程度[21,43-44]。

3.2影响耗竭T细胞功能状态逆转的因素 虽然通过阻断抑制性受体及配体或某些细胞因子来逆转T细胞耗竭状态的方法在临床上已经成为慢性感染和肿瘤的治疗性干预措施,但其效果受到很多因素的影响。首先,治疗开始前T细胞耗竭的程度不同会导致治疗效果的不同[22]。而且PD-1阻断的有效性取决于T细胞群的性质,如PD-1阻断可以逆转PD-1intT细胞(PD-1中量表达T细胞)的耗竭,但不能逆转终末分化的PD-1hiT细胞(PD-1高表达T细胞)[45]。且阻断PD-1后耗竭CD8+T细胞的再活化必须依赖于CD28信号的传导[46]。此外,耗竭T细胞的再激活可能依赖于T细胞与B7+造血细胞的相互作用,如树突状细胞[47-48]。尽管阻断抑制性受体对细胞免疫应答具有改善作用,但也可能发生不利影响。这些不利影响可以由增强的T细胞应答引起的免疫病理改变引起,如果在慢性LCMV感染过程中过早阻断PD-1受体通路,则会发生这种免疫病理改变。在感染猴免疫缺陷病毒的猕猴体内阻断CTLA-4会出现其他抑制性分子使淋巴细胞反应降低,导致CD4+T细胞的损失和病毒载量的增加,反而降低了抗病毒治疗的效果[49]。

4 耗竭T细胞与细菌感染性疾病的关系

对耗竭T细胞的研究主要集中在慢性病毒感染和肿瘤方面,但已有研究表明在多种细菌感染中也存在T细胞耗竭现象。

在幽门螺杆菌感染的体外实验中发现,当胃上皮细胞受到幽门螺杆菌持续性刺激时会出现PD-L1高表达,PD-L1可以抑制T细胞增殖,用特异性抗体阻断PD-L1后可以逆转该抑制作用[50]。体内研究中同样发现了T细胞耗竭现象。在小鼠布鲁氏杆菌感染实验中,与急性感染或非感染小鼠相比,来自慢性感染小鼠的脾脏中耗竭表型的CD8+PD-1+LAG-3+细胞明显增加,而这些耗竭表型的CD8+T细胞缺乏IFN-γ的表达。 这些结果表明,布鲁氏杆菌慢性感染导致CD8+T细胞出现耗竭状态从而限制其免疫功能[51]。在感染MTB的小鼠模型中发现,MTB慢性感染期间T细胞高表达Tim-3,且这些T细胞同时表达包括PD-1在内的其他抑制性受体,同时IFN-γ表达降低,IL-10表达增高,并表现出功能障碍,无法有效清除细菌。而阻断Tim-3可逆转T细胞的功能并且改善对MTB的控制[52]。

在相关临床研究中同样发现了T细胞的耗竭现象。活动性肺结核患者与健康人相比，PD-1在CD4+T细胞中表达增加而在CD8+T细胞中没有增加。此外,与健康对照相比,PD-L1和PD-L2在MTB感染患者的单核细胞中表达上调。阻断CD4+T细胞和巨噬细胞上的PD-1/PD-L1途径增强了巨噬细胞体外吞噬作用和细胞内杀灭MTB的作用,表明PD-1在MTB感染中具有免疫负调节作用[53]。在败血症患者体内也有类似的发现。在多重药物耐药性( multidrug-resistant,MDR)细菌性脓毒血症患者中发现,与非脓毒血症患者相比,感染MDR细菌的脓毒血症患者的抑制性受体PD-1及其配体PD-L1的表达上调。3种免疫佐剂包括IL-7、抗PD-L1和OX-40L,在MDR细菌性脓毒血症患者中有效增加了T细胞的IFN-γ产生率[54]。

在口腔研究领域，耗竭T细胞重要的分子标记物之一PD-1/PD-L1与慢性口腔疾病之间的关系也引起了关注。相关临床研究发现，PD-1、PD-L1、CTLA-4在慢性根尖周炎病损部位的表达量明显高于对照组。牙周炎患者外周血单核细胞中CD4+T细胞和CD8+T细胞的PD-1表达量明显高于牙龈炎患者和健康人,而经过牙周基础治疗后PD-1及PD-L1的表达量较治疗前有不同程度的降低[55-56]。也有研究表明 T 淋巴细胞表面 PD-1的表达量与血清及龈沟液中 IL-1β、IL-8、TNF-α、sICAM-1、sVCAM-1、MMP-1、MMP-7、MMP-13等致炎因子的含量呈正相关[57]。

5 展望

目前关于耗竭T细胞发生与发展机制已有大量研究,相关的动物实验及临床研究也为免疫靶向治疗揭示了新的可能性。然而,对耗竭T细胞的研究及应用主要集中在病毒及肿瘤领域,在许多慢性感染性疾病中的研究尚不充分。细菌感染后若不能被宿主尽快清除,可能通过各种不同途径限制宿主的免疫功能,细菌感染性疾病由此在宿主体内变得迁延不愈,使感染和炎症慢性化，T细胞的耗竭可能是其中重要原因之一。为慢性感染性疾病的防治提供新思路。