肺炎支原体P1蛋白的研究进展

彭凯岚，曾焱华

肺炎支原体作为社区获得性肺炎的常见病原体之一，对它的认识在临床工作中有重大意义。肺炎支原体的致病机制主要是通过黏附呼吸道上皮细胞从而破坏黏膜上皮，引起炎症反应[1]；而失去黏附能力的肺炎支原体菌株成为无毒株，因此，人们将黏附细胞器作为重点进行研究。其中P1蛋白作为主要黏附蛋白，不仅在黏附过程中发挥重要作用，同时也参与肺炎支原体的滑行运动，使其能够从支气管纤毛尖端转移到宿主细胞表面；此外，P1蛋白含有多个抗原决定簇，具有很强的免疫原性，其相应的抗体可在感染患者的血清中检测到，为肺炎支原体感染的血清学诊断和疫苗研制提供了新思路。本文对P1蛋白的基因结构与分型、功能及其在血清学诊断与疫苗制备方面的应用进行综述。

1 P1蛋白的基因结构与分型

1.1P1蛋白的基因结构 肺炎支原体基因组全长816 bp，构成其黏附细胞器的主要蛋白P1基因(MPN141)含4 884 bp，GC含量为53.5%，P1蛋白的分子量为170 kDa，是肺炎支原体最大的黏附蛋白，直接与宿主细胞膜相互作用，其基因序列中包含21个编码色氨酸的UGA密码子，但UGA在大肠杆菌表达系统中编码终止密码子，因此，全长P1重组蛋白的表达一直未曾有进展，研究者多用片段表达进行相关实验。P1基因位于P1操纵子内，该操纵子中还包含两个开放阅读框(ORF)：ORF4和ORF6。ORF6经共翻译修饰编码蛋白B(P90)和蛋白C(P40)，在上述蛋白的协助下P1蛋白与细胞骨架蛋白相互作用并聚集于黏附细胞器顶端。肺炎支原体基因组中共有RepMP1、RepMP2/3、RepMP4和RepMP5 4种重复序列。而P1操纵子中含有其中3种，即：位于P1基因3′端的RepMP2/3和5′端的RepMP4，以及ORF6内的RepMP5[2]。事实上，所有RepMP都有1个拷贝存在于该操纵子内或邻近该操纵子，这表明所有的RepMP元件都可能是这段基因的残基。同时，在肺炎支原体中，通过滑动错配引起序列变异性的短串联重复序列仅在P1基因中出现[3]。上述基因结构使得P1基因序列具有多态性，是P1蛋白抗原变异的基础。

1.2P1蛋白的基因分型 P1蛋白基因是肺炎支原体临床分离菌株分型的重要标志[4]。在P1蛋白的概念被提出后，研究者用Southern blot和PCR-RFLP对其基因进行分析，并根据其RepMP2/3和RepMP4元件的特点将肺炎支原体分为两型，即目前常用的P1-Ⅰ和P1-Ⅱ分型。流行病学调查发现肺炎支原体的型别每9～10年发生1次转变[5]，目前我国P1-Ⅰ型的流行率更高[6]。关于不同基因型致病力的强弱一直有争论，有学者认为P1-Ⅱ型的致病力比Ⅰ型强[7]，Maria等[8]通过蛋白质组学分析，证实Ⅱ型菌株比Ⅰ型菌株产生的毒素更多；而对儿科患者的临床评估却显示感染Ⅰ型肺炎支原体患者发生重症支原体肺炎和肺外并发症的风险明显高于Ⅱ型患者[9]。Li等[10]对两例病程截然不同的肺炎支原体感染患者分离物进行测序，发现两个分离物之间的主要差异存在于P1蛋白基因中，由此推测P1蛋白的突变有可能改变肺炎支原体的致病性。

在随后的临床样本分子分型中，更多的肺炎支原体亚型开始出现在人们的视野中[11]，Dorigo等[12]通过RFLP分析将P1-Ⅰ型分为1a～1e 5个亚型，P1-Ⅱ型分为2a～2c 3个亚型。有研究者对大量样本进行测序和比对发现，肺炎支原体亚型的产生是由于MPN141内的RepMP2/3和RepMP4元件与基因组其他部位的RepMP2/3和RepMP4发生同源DNA重组引起的，且RepMP4可能比RepMP2/3更具遗传多态性。后续的实验则进一步证实了肺炎支原体基因组中的任意两个RepMP元件之间都可以发生同源DNA重组，甚至可以发生2次重组，对肺炎支原体内所有的RepMP元件进行编号分析发现，在分离的菌株R1108/01和R0109/01中发现RepMP4-c的一部分被来自RepMP4-g的序列替换，导致P1蛋白中的15个氨基酸发生了替换，RepMP2/3-d的一部分被来自RepMP2/3-a的序列替换引起29个氨基酸的修饰[13]。Qiu等[14]对中国1起支原体肺炎暴发性流行中的菌株的RepMP2/3和RepMP4元件进行检测，在P1-Ⅰ型的RepMP2/3元件中发现一段新的核苷酸片段，共有28个突变，引起24个氨基酸替换；在P1-Ⅱ型的RepMP4元件中发现31个突变。这些同源重组和突变可能是肺炎支原体出现耐药性和免疫逃逸的主要原因[15-16]。

2 P1蛋白的功能

P1蛋白不含半胱氨酸，因此无法形成分子内二硫键，为其多肽链带来了相当好的灵活性，而其羧基末端的脯氨酸含量较高，对细胞黏附素的拓扑结构起到调节作用。P1蛋白包括3个结构域，分别为保守的结构域Ⅰ，以及跨膜片段连接的结构域Ⅱ和Ⅲ[17]。然而，由于P1蛋白是1个由1 627个氨基酸残基组成的大蛋白，并且在C末端有1个跨膜片段，目前还没有关于重组全长P1蛋白的研究，这是探索P1蛋白详细结构的主要障碍。Kenri等[18]首次分离了具有均匀折叠结构的重组P1蛋白，具有正确折叠的蛋白有助于我们阐明P1蛋白的详细结构和功能。

2.1P1蛋白与细胞黏附 P1蛋白的主要功能是参与肺炎支原体对宿主细胞的黏附，在P1蛋白的介导下成功寄生于呼吸道黏膜的肺炎支原体并不侵入细胞，而是黏附并隐藏在细胞间隐窝内，逃避纤毛运动的清除作用和巨噬细胞的吞噬，释放毒力因子，损伤宿主细胞。而失去黏附功能的P1蛋白缺失株则成为无毒株[19]。事实上，P1蛋白无法单独完成对细胞的黏附，同时参与黏附的蛋白还包括P30、P116，以及蛋白质A、B、C。散在分布于胞膜的P1前体蛋白在肺炎支原体与靶细胞接触后，酶切水解为成熟的P1，两分子P1和两分子蛋白B形成P1黏附素复合体并与细胞骨架蛋白相互作用，在HWM1～3的协助下，聚集于黏附细胞器顶端[20]。蛋白B和蛋白C丢失将直接导致黏附细胞器的缺失。P1蛋白的正确定位依赖HMW1的作用，HMW1-2缺失时，P1蛋白无法定位至细胞骨架结构，无法到达肺炎支原体表面；当辅助蛋白均缺失时，P1蛋白不集中在肺炎支原体细胞顶端，而是均匀分布在细胞膜上[21]。而J-结构域蛋白(TopJ)也在黏附细胞器的形成过程中发挥重要作用，通过激活分子伴侣蛋白DnaK的ATP酶，催化黏附细胞器的蛋白结合及其正确折叠，TopJ突变肺炎支原体表现为黏附细胞器中P1、P30、P41的聚集减少[22]。P1和P30可直接参与受体结合，P30基因突变的肺炎支原体菌株中，黏附蛋白复合体中P1蛋白的密度也降低[23]。此外，肺炎支原体在非生物表面的黏附和生物被膜的形成都与P1蛋白有关，抗P1抗体可抑制生物被膜的形成[24]。Widjaja等[25]将菌体内的P1蛋白进行分离，发现P1蛋白可被切割加工为22种蛋白形式，且每种蛋白形式都可分别与不同的宿主分子或其结构模拟物相结合，如人类肺癌细胞A549表面蛋白复合物、肌动蛋白、纤连蛋白等，推测经过加工的P1蛋白可能在细胞中发挥多种作用，甚至可释放至细胞外环境中，通过免疫诱导机制保障肺炎支原体的定植。

2.2P1蛋白与炎症反应 P1蛋白的强免疫原性，可刺激宿主免疫系统对其进行免疫应答。Heok等[26]发现，黏附型肺炎支原体可诱导鼠嗜碱性粒细胞中IL-4的产生，非黏附型肺炎支原体则无法有效诱导细胞因子反应，而上述两者的主要差别在于黏附型肺炎支原体富含P1蛋白，说明P1蛋白在IL-4的合成与释放过程中起关键作用，而神经氨酸酶可消除肺炎支原体对IL-4的诱导作用，P1蛋白可能通过直接与唾液酸残基接触诱导炎症反应。将肺炎支原体感染患者的血细胞与经P1蛋白刺激的健康献血者外周单个核细胞进行对比分析，发现P1蛋白可激活Th细胞，使巨噬细胞增殖，促使Th0细胞向Th2细胞分化，分泌IL-4和IL-5，引起免疫功能和细胞因子分泌紊乱，诱导B细胞抗体类别向IgE转变，从而引起强烈的哮喘[27]。此外，P1蛋白与哺乳动物的细胞骨架角蛋白和纤维蛋白原α链前体都有着广泛的同源性，可能与肺炎支原体感染后出现的自身免疫性病理生理机制有关，通过引起自身免疫应答，造成肺外组织病变[28]。尽管多种研究表明肺炎支原体参与细胞黏附的蛋白(P1、P40、P90)是其致病的重要因素，但细胞黏附具体的致炎机制尚未明确[29]。

2.3P1蛋白在滑行中的作用 肺炎支原体的滑行运动可使其向宿主细胞表面受体靠近，促进病原体的进一步扩散。电子冷冻断层扫描证实P1蛋白也参与肺炎支原体的滑行运动，抗P1单克隆抗体可以浓度依赖的方式降低已黏附的肺炎支原体的滑行速度[30]。Williams等[31]发现P1蛋白可与α-2,3、α-2,6两种唾液酸乳糖结合，但仅在与α-2,3唾液酸乳糖结合时可发生滑行。肺炎支原体的滑行机制与目前已知的滑行机制皆不相同，其滑行也由黏附细胞器介导，其中的厚板延展或压缩可引起整个黏附细胞器的伸长或缩短，P1黏附素复合物作为其表面结构则反复地与宿主细胞表面受体(即唾液酸寡糖)结合和分离，细胞器前端的P1蛋白先发生分离，在细胞器伸长后又优先结合，从而使病原体不断向前运动[17]。多位学者已对肺炎支原体的滑行机制提出了有依据的猜想[32]，但是，需要更多的信息来阐明这种独特的机制，包括其中涉及的蛋白质和复合物的结构与功能及其动力系统。

3 P1蛋白在血清学诊断中的应用

肺炎支原体感染与流感症状相似，无特异性临床表现。因此，对临床医生来说，早期和准确的诊断是必要的，以便开出正确的抗生素治疗处方。目前常用的肺炎支原体诊断方案，细菌培养耗时长、敏感性低、特异性差。尽管诊断手段多样，但针对肺炎支原体的诊断还有待进一步研究。

P1蛋白是在人和实验动物中能诱导强体液免疫反应的主要黏附蛋白，是作为血清学诊断抗原的潜在候选物。然而，全长P1蛋白与其他支原体蛋白之间存在共同的抗原决定簇。因此，研究者们试图筛选出其中肺炎支原体特异性的抗原表位，并将其与其他抗原表位联合使用。

3.1P1蛋白特异片段筛选 近年来，生物信息学在分子生物学领域广泛应用，有学者利用生物信息学对P1蛋白的抗原表位进行预测并将其进行表达纯化，结果表明两个位于P1蛋白C端的重组蛋白皆可被肺炎支原体感染患者的血清样品识别，且抗重组蛋白血清和其他呼吸道抗原之间没有交叉反应[33]。Chourasia等[34]在大肠杆菌内分别表达了P1蛋白的N端和C端，并将纯化的蛋白与目前通用的ELISA试剂盒进行比较，发现P1-C1具有很强的免疫反应性。有学者利用密码子优化，将P1基因分为4段分别表达，发现P1蛋白的免疫优势区分布在P1蛋白的全长上，而黏附区位于N端和C端。Beghetto等[35]构建了肺炎支原体的全基因组文库，通过噬菌体展示技术筛选到4个新的免疫原性多肽；在该实验中，大多数感染者血清都可与P1蛋白的1个片段发生阳性反应，该片段对应P1蛋白中的第1 159-1 521位残基，这一发现不仅与Chourasia等人的实验相符，同时也提示了噬菌体展示系统在抗原筛选中的应用价值。在本课题组以前的研究[36]中，我们表达纯化了P1蛋白的1 160-1 498位氨基酸并制备了其相应的多克隆抗体，对噬菌体展示随机12肽库进行生物淘选，发现多肽HLQMRLTKLRMP可与多克隆抗体特异性结合，且与肺炎支原体P1蛋白的1 266-1 272位氨基酸(QVRTKLR)有75%的同源性，表明该多肽可能为P1蛋白的优势模拟表位，与患者血清进行ELISA试验发现其敏感性和特异性都很好，可用于肺炎支原体感染的血清学诊断。

3.2P1蛋白与其他蛋白片段的联合使用 Montagnani等[37]对肺炎支原体抗原的免疫优势B细胞表位进行筛选，并通过基因工程分别表达了P1、P30和MPN456的片段，以及上述3段蛋白的融合蛋白EC-12，分别与确诊病例、疑似病例以及链球菌感染患者的血清进行ELISA实验，与商业试剂盒比较发现，重组蛋白的敏感性高于传统全菌抗原，尤其以融合蛋白EC-12的敏感性最高，且重组抗原能有效地鉴别肺炎支原体感染者和非感染者。Hélène等[38]评估了肺炎支原体ATP合成酶β亚基(AtpD)和P1蛋白C末端(P1-C)片段融合抗原的诊断性能，发现其与成人血清样本IgM反应的阳性率达到80%，比商业试剂盒和上述两种抗原单独使用的阳性率都要高，曾有学者认为青少年在急性感染时有着较高水平的IgM抗体，而成年人则缺乏IgM，该实验表明成年感染者血清中也存在IgM抗体，只是由于检测抗原灵敏度较低而被忽视，而rAtpD-rP1-C抗原对IgM的高灵敏性有助于提高肺炎支原体感染的早期特异性诊断，值得注意的是，该抗原对IgA和IgG的灵敏度较差。

4 P1蛋白与疫苗制备

肺炎支原体感染可引起多种疾病，每年秋冬季多发，随着耐药菌株的出现，肺炎支原体的防治，尤其在疫苗研制方面，成为了医疗卫生行业关注的重点[39]。目前得到应用的肺炎支原体疫苗多用于动物，还没有可供临床使用的疫苗。P1蛋白抗原的特异性强，其中和抗体可阻止肺炎支原体对宿主细胞的黏附。在利用P1蛋白的强抗原性进行感染诊断的同时，研究者们也利用这一特性研制相关疫苗。

早期有学者发现，在肺炎支原体感染患者的血清中存在高滴度的P1特异性抗体，但这些患者却不能避免二次感染，对患者血清的黏附抑制功能进行实验，发现P1蛋白诱导的抗体大多不针对P1蛋白的细胞黏附位点。因此，大多数学者在对P1蛋白片段进行筛选后，将其与其他特异性抗原联合使用，以期达到特异且高效的作用。Schurwanz等[40]将P1蛋白分为15段分别表达，与肺炎支原体感染的豚鼠血清和肺炎支原体阳性患者血清反应，发现第14段免疫原性最强，将该段蛋白与P30蛋白构建成为融合蛋白，免疫豚鼠，产生的抗体可显著降低肺炎支原体对人肺支气管上皮细胞的黏附能力。Hausner等[41]则用P1和P30蛋白的表面暴露及黏附相关区域构建了嵌合重组蛋白HP14/30，可在豚鼠呼吸道中诱导出稳定、持久、高水平的IgA，且该血清具有抑制黏附的作用。朱翠明等[42]在证实P1 蛋白C端1 125-1 395段重组蛋白可刺激小鼠产生特异性抗血清后，将P1蛋白C端分别与IL-2和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)融合制成核酸疫苗，发现与单独的P1蛋白C端相比，上述两种核酸疫苗可有效诱导免疫应答，但P1C-IL-2疫苗会引起较强的肺组织炎症。Chen等[43]将P116N、P1C和P30 3种黏附蛋白片段制成嵌合蛋白(MP559)，并用其免疫兔，发现用MP559免疫的兔可产生针对P116N、P1C和P30的抗体，且MP559能与P116N、P1C和P30免疫的兔血清发生反应，这种融合蛋白有望取代上述3种抗原成为候选疫苗分子。

5 总结与展望

肺炎支原体是引起呼吸道感染的重要病原菌，其致病过程为：黏附、增殖、释放毒力因子；其中黏附过程为肺炎支原体感染的重要环节，针对其主要黏附蛋白P1做出的一系列研究，可了解肺炎支原体的致病机制，从而对其进行诊断、治疗与防治。P1蛋白不仅参与病原体的黏附过程，其在滑行与炎症反应中也发挥重要作用，主流的研究方向认为P1蛋白主要定位于肺炎支原体黏附细胞器表面，但有研究发现肺炎支原体感染患者的抗体常结合于与黏附无关的P1蛋白片段[40]，因此，有学者提出P1蛋白可能在经过切割与加工后释放至细胞外环境中，中和抗体，发挥免疫诱饵机制[25]，为P1蛋白在宿主体内发挥的作用提供了无限猜想。本文讨论了肺炎支原体P1蛋白在结构、功能、诊断和预防方面的研究进展，尽管目前对P1蛋白的基因结构、氨基酸构成已有所了解，但P1基因型的变异性与肺炎支原体耐药及免疫逃逸之间的关系、P1蛋白的完整结构、P1蛋白与黏附蛋白间的相互作用、P1蛋白与宿主细胞表面受体的相互作用、P1蛋白在炎症反应中的作用及其在疫苗中的应用还有待进一步探明。

利益冲突：无