生殖毒性替代试验在中药安全性评价中的应用研究进展

杨 威，郭健敏，陈文培，雷夏凌，柳 璐，韩 玲

（1.广东莱恩医药研究院有限公司，广东省药物非临床评价研究企业重点实验室，国家中药现代化工程技术研究中心中药非临床评价分中心，广东省创新药物评价与研究工程技术研究中心，广东 广州 510990；2.国家药品监督管理局药品审评中心，北京 100022；3.香港科技大学，香港 999077）

生殖毒性研究是药物非临床安全性评价的重要内容，是创新药物研发中的必经环节。国内外对传统小分子化药和中药等进行药物评价时，多采用经典的三段式动物试验评价法。经典方法使用动物数量多，试验周期长，试验费用高，增大了药物研发的风险。为弥补经典方法的不足，生殖毒性替代试验方法应运而生。欧洲替代方法验证中心（Euro⁃pean Centre for the Validation of Alternative Method，ECVAM）于1996-2000年验证并推荐3个替代试验，分别为胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESC）试验（ESC test，EST）、胚胎细胞微团培养（embryonic cell micromass culture，MM）试验和全胚胎培养（whole embryo culture，WEC）试验，以评估其区分无胚胎毒性、弱胚胎毒性和强胚胎毒性药物的准确性［1］。验证结果表明，3种体外胚胎毒性试验能够将具有胚胎毒性的化合物进行分类（无、弱或强胚胎毒性），准确性分别达78%，70%和80%，而且三者对强胚胎毒性化合物的灵敏度高达100%。3种体外胚胎毒性试验的可重复性是可接受的。

2009-2016年，多项研究［2-4］对斑马鱼胚胎发育毒性模型的评价方法进行了验证。22种已知胚胎毒性的化合物的验证结果表明，所有化合物的斑马鱼试验结果与传统动物试验及临床表现一致［2］，灵敏度为100%，特异性为100%，提示斑马鱼胚胎发育毒性模型可用于区分致畸性和非致畸性化合物，斑马鱼胚胎发育毒性试验可作为发育毒性评价的又一替代试验。

中药应用历史悠久，随着中药国际化浪潮的掀起，现代中药研发和毒性评价循证于“临床-非临床-临床-上市后研究”模式而实现全程式中药安全评价和监管。全程式中药安全评价和监管提出，对研究薄弱的特殊毒性如生殖毒性、遗传毒性和致癌试验等，更应该贯彻执行“动物试验发现潜在毒性-临床试验继续完成毒理学研究-上市后再评价”的评价监管策略［5］。受历史和科技条件的限制，多数中药在应用于人体之前并未按要求进行严格的生殖毒性评价。国家食品药品监督管理局药品审评中心于2008-2016年受理审评的792个中药新药品种，仅5.3%提供了生殖毒性研究资料［6］。即使是《中华人民共和国药典》（2015版）收录的83味毒性中药，亦只是部分进行了生殖毒性评价［7］。人体生殖毒性宏观水平检查的不足以及伦理上的限制，均意味着特定生殖毒性临床试验的难实现性以及非临床研究的迫切需求［8］。随着国家对中药新药研发重视程度的提高（如即将到来的经典名方研究），必将推动中药安全性评价要求和水平的提高，也必将研发出更多安全有效的中药新药。

无论是目前临床上正在使用的中药或是创新中药新药，若是均按经典方法进行全面的生殖毒性评价，无疑将会耗费大量的资源。但若采用替代试验对中药进行生殖毒性研究，并优先对替代试验中发现有毒性的中药进行全面的生殖毒性评价；对替代试验中未见明显生殖毒性的中药延后进行生殖毒性研究，这样则非常有利于推动中药生殖评价和中药生殖毒性背景数据库的建立。本文就常见的4种生殖毒性替代方法及其在中药评价中的应用进行综述。

1 胚胎干细胞试验

1.1 原理和方法

ESC是早期胚胎中分离出来的一类细胞，具有可体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。无论在体外还是体内环境，ESC在特定条件下均能被诱导分化为机体几乎所有类型的细胞。验证的EST是通过检测受试物对ESC D3细胞分化为心肌细胞的过程的影响，结合受试物对ESC与纤维母细胞3T3细胞毒性实验的结果，判断受试物对胚胎发育的毒性［9］。

ESC试验包括细胞毒性试验和分化试验。细胞毒性试验使用小鼠纤维母细胞系3T3细胞和未分化的小鼠ESC D3细胞，以源自浓度-反应曲线的3T3半数抑制浓度（3T3 50% inhibitory concentra⁃tion，IC503T3）和IC50D3为终点反映细胞毒性。分化试验使用小鼠D3细胞，以源自浓度-反应曲线的D3半数抑制分化浓度（D3 50% inhibited differenti⁃ation，ID50D3）为终点来反映细胞毒性。将上述终点参数代入判别函数进行计算，对受试物进行无胚胎毒性、弱胚胎毒性和强胚胎毒性分类。

1.2 优缺点和改进方法

ESC独有的特点是能够在体外分化成胚胎的所有成分，包括形成每一个胚胎层（如外胚层、中胚层和内胚层）以及这些胚体细胞后续的分化。因此，这个模型能评估多种与胚胎发育相关的事件。优点是它可直接评估受试物对胚胎干细胞分化程度和对体细胞的毒性和（或）促增殖作用［10］。缺点是试验系统使用的是小鼠细胞系，外推到人有不确定性；另外，其终点为形态学终点，要求操作人员有非常好的辨别心肌细胞搏动的经验，检测通量相对较低。

针对以上局限性有学者提出改进。例如，试验系统可使用人ESC源多能干细胞，减少外推的不确定性，也可把胚胎发育不同阶段进行细分类，在ESC定向分化过程中给予毒性物质干预建立特异性EST，也可使用人诱导多能干细胞，其具有与人ESC相同的分化能力且不涉及生物学伦理问题［11］。检测终点方面可使用分子生物学技术检测分化基因标志物（如心肌细胞特异肌球蛋白重链蛋白）的表达［9］，也可同时检测药物对非心肌细胞分化（成骨分化、软骨分化和神经分化等）的抑制作用［12］。另外，胚胎毒性物质作用引起小鼠D3胚胎干细胞分化细胞的场电位、心肌跳动结果具有一致性［13］，因此可通过检测场电位而实现高通量筛查。

1.3 在中药胚胎及发育毒性评价中的应用

Li等［14］运用EST评估了白术、板蓝根、黄连和芫花的胚胎毒性。测得白术的终点IC503T3，IC50ESC和ID50ESC分别为4.82，42.42和37.67 g·L-1，板蓝根的终点结果分别为1.76，27.68和15.00 g·L-1，黄连的终点结果分别为0.40，2.73和1.06 g·L-1，芫花的终点结果分别为0.51，0.75和1.15 g·L-1。分类结果表明，白术和板蓝根无胚胎毒性，黄连为弱胚胎毒性，芫花表现出强烈的胚胎毒性。张崴等［15］采用EST，通过实时定量PCR技术测定分化心肌细胞β肌凝蛋白重链mRNA评估黄芩苷的胚胎毒性。结果表明，黄芩苷具有弱胚胎毒性。夏荃等［16］基于EST评价川芎水煎液的胚胎毒性，发现川芎水煎液具有弱胚胎毒性；而该课题组前期进行的在体生殖毒性试验结果也显示，小鼠在摄入川芎32 g·kg-1剂量（相当于临床剂量的16倍）时存在死胎和吸收胎增加及胸骨和四肢骨骼发育畸形的情况；以上结果表明，川芎具有胚胎发育毒性。张志伟［17］用生半夏对Wistar大鼠连续ig给予3 d，获取含药血清以制备不同配伍的含药血清，继而对小鼠ESC进行干预。结果发现，生半夏粉剂组ESC增殖活性被显著抑制，生半夏汤剂和粉剂可促进ESC晚期凋亡。以上结果表明，生半夏粉在剂量为每天3.45 g·kg-1时具有显著的胚胎毒性，而干姜人参半夏汤或粉剂无明显的胚胎毒性，作者推测这可能是通过“生姜解半夏毒”的作用机制实现的。

2 胚胎细胞微团培养试验

2.1 原理和方法

MM试验通过观察培养细胞形态、集落形成数量、基质变化和超微结构变化评价外源性化学物质对胚胎是否存在毒性作用，是介于单细胞培养和器官培养之间的一种体外实验技术［18］。

ECVAM验证的MM试验使用的是大鼠肢芽细胞微团。在大鼠孕14 d时取出胚胎，显微镜下分离四肢肢芽，制备单细胞悬液，与受试药物共培养，以阿利新蓝染色法和中性红染料摄入法测定活细胞总数、分化细胞数和细胞团数，评估肢芽细胞的生长和分化。MM试验以抑制阿利新蓝染色ID50和降低中性红摄取IC50为终点［18］，计算所得判别值，预测受试物的胚胎毒性并分类。

2.2 优缺点和改进方法

MM试验周期短，操作相对简单，作为体外试验也具有干预条件可控等优点，但在ECVAM验证的3种方法中其准确性相对较低，原因可能为验证的MM试验使用的是肢芽微团，侧重于枝芽细胞向软骨细胞的分化，更适用于区分强致畸毒性、弱致畸毒性和无致畸毒性物质［19］。选择对生命影响程度不同的组织细胞微团进行研究，能对受试物的胚胎毒性（心肌等）、致畸毒性（骨和上颚等）进行预判和致畸部位辩别［10］。

2.3 在中药胚胎及发育毒性评价中的应用

MM试验在中药胚胎毒性研究方面具有非常明显的优势，因其不仅能观察受试物的直接影响，还可研究代谢产物的毒性。将受试物和（或）代谢活化系统加至细胞培养液中，可观察受试物体外代谢产物的细胞毒性和致畸性［20］；也可将妊娠大鼠暴露受试物一段时间后，取出微团细胞进行培养，观察受试物体内代谢转化产生的细胞毒性和致畸性［21］。

刘星等［22］ig给予雄性SD大鼠菟丝子10，20和40 g·kg-1，制备菟丝子含药血清。体外培养大鼠胚胎前肢芽器官和后肢芽细胞微团，培养过程中加入含药血清干预。结果表明，与阴性对照组相比，菟丝子40 g·kg-1组指突不明显，掌指骨发育分化较差，形成集落数少，骨形态发生蛋白2表达水平低，表明菟丝子40 g·kg-1含药血清可抑制大鼠肢芽软骨的发育和肢芽细胞的分化，菟丝子存在潜在的胚胎发育毒性。李丽娟等［23］取孕13 d小鼠胚胎后肢芽制备单细胞混悬液，加入相当于406.25，1625.00和3250.00 mg生药·L-1的续断水煎液，结果在所采用的剂量范围内未发现续断对胚胎肢芽细胞生长发育的毒性，反而发现各剂量均不同程度地促进肢芽细胞的增殖和分化，并抑制肢芽细胞坏死和凋亡。韦兴邦等［24］用不同比例的布依族经方神阙散含药血清干预正常大鼠中脑微团细胞，发现含神阙散代谢产物的大鼠血清对中脑微团细胞的分化和增殖均未产生影响，从而初步判断在其试验剂量下神阙散无致畸毒性。

3 全胚胎培养试验

3.1 原理和方法

WEC试验以正处于器官形成期的胚胎为研究对象，此期的胚体组织对外在的物理和化学等因素极为敏感。ECVAM验证的WEC试验是在大鼠妊娠第10天，取体节数为1～5的胚胎在大鼠血清中旋转培养48 h，以胚胎心跳和血液循环为胚胎存活指标，卵黄囊直径、颅臀长和体长、体节数及胚胎质量作为配套胚胎生长发育指标，按Brown&Fabro定义的改良评分系统对包括17项器官分化形态指标进行评分。每浓度和对照孔分别收集7个胚胎的数据，以对照组的平均总形态学得分（total morpho⁃logical score，TMS，为评分系统中所有器官分数的总和）为100%，计算各浓度的TMS。同时记录每组胚胎畸形的数量和特征，计算各浓度组畸形或死亡胚胎的比例。WEC试验有2个预测模型（prediction model，PM），PM1以畸形或死亡胚胎的无效应浓度（ICNOEC）、IC50和ICmax为终点；在此基础上，PM2补充3T3细胞毒性指标IC503T3［25］。

3.2 优缺点和改进方法

WEC试验是一个完整的生物体模型系统，其优点是比体内试验的相似度高，试验周期短，评价效率高。Zhu等［26］使用沙利度胺初步验证兔胚胎的WEC试验，仍需要多类别的确证生殖毒性药物进行验证。WEC试验不足之处为其隔离了母体影响（代谢和毒性），无法呈现母体-胎儿相互作用。可选择性地加入母体因素到培养系统以弥补母体影响的缺失［10］，还可增加功能性终点、细胞死亡标志物和形态学改变标志物等。

3.3 在中药胚胎及发育毒性评价中的应用

肖凯［27］将10.5日龄大鼠胚胎与含不同浓度生草乌的大鼠血清培养，发现当生草乌浓度≥1.25 g生药·L-1具有抑制组织器官分化的毒性作用，浓度≥2.5 g生药·L-1具有影响胚胎生长发育的毒性作用，且毒性效应均具有剂量相关性。柳鹏等［28］将8.5日龄小鼠胚胎于含不同浓度人参皂苷Rb1的大鼠血清中培养，发现人参皂苷Rb1浓度≥30 mg·L-1对胚胎多个组织器官的分化有明显抑制作用，其中40 mg·L-1即使胚胎体节数量减少，50 mg·L-1时卵黄囊直径和头长也明显缩短。该研究结果表明，人参皂苷Rb1在暴露剂量≥30 mg·L-1时具有一定的发育毒性，且认为其发育毒性的作用机制可能是对卵黄囊胎盘结构和功能的影响。

吡咯里西啶生物碱广泛存在于世界上6000余种植物中。止咳化痰中药款冬花含有13种吡咯里西啶生物碱，其中克氏千里光碱含量最高［29］。韩佳寅等［30-31］运用WEC试验评价克氏千里光碱、千里光菲灵碱和倒千里光碱的胚胎毒性。结果表明，克氏千里光碱和千里光菲灵碱浓度≥25 mg·L-1时对胚胎的生长发育和形态分化均具有毒性；倒千里光碱浓度≥12.5 mg·L-1时抑制器官组织分化，浓度≥25 mg·L-1时影响胚胎生长发育。上述结果与该课题组前期研究千里光水提物、总生物碱提取物以及含千里光的中药复方千柏鼻炎片对大鼠均有一定的致畸作用的结果一致，揭示总生物碱可能是含吡咯里西啶生物碱类植物的主要致畸成分群。

4 斑马鱼胚胎发育毒性模型

4.1 原理和方法

斑马鱼是除人和小鼠外的第3种模式动物。斑马鱼基因与人类基因的相似度高达87%，且其胚胎在母体外发育，胚胎小，发育时间很短〔受精后24 h（postfertilization 24 h，24 hpf）原代神经元细胞开始分化，48 hpf后形成脑室，72 hpf整个器官形成期完成，6 d后形成所有的神经系统〕，因此斑马鱼可作为评价药物潜在胚胎发育毒性的理想模型［3］。

试验时将雌雄斑马鱼按1∶2的比例交配，显微镜下剔除未受精的胚胎备用。将受试药物先放入培养箱中预温，然后在1～2 hpf内选取发育正常且一致的胚胎，每孔放入15～20只，置28～29℃培养箱中培养。4 hpf选出发育正常的胚胎并置装有待测药物的24孔板中，每孔1只，每板设2个浓度。继续置培养箱中培养至144 hpf。在24，48，72和144 hpf用显微镜对眼、尾部延伸、心脏搏动、血液循环和自主游动等进行观察，记录死亡数和畸形数。正常胚胎用0表示，畸形胚胎用1表示，计算致死率和致畸率［3］。

4.2 优缺点和改进方法

斑马鱼最明显的优势为其强大的繁殖能力，短期内可提供大量样本，试验成本相对较低。斑马鱼胚胎生长速度快，发育时间短，可在短的试验周期内覆盖胚胎发育的全过程；并且胚胎透明，易于观察，可进行靶器官的筛选。此外，斑马鱼具有一个非常独特的优势，即48 hpf内即可完成受试物心脏毒性测试，灵敏度达到ECVAM对替代毒性试验推荐原则中“极好”的范畴［32］。吸收、分布、代谢和排泄是影响药物毒性的关键因素。尽管斑马鱼肝表达与人体代谢相似的细胞色素P450酶如CYP3A4，但酶功能及其代谢药物的过程与人体的差异还有待研究。最近研究报道，改良的斑马鱼试验能对化合物的致畸能力进行定量预测及分级，预测能力达88%［33-35］。但验证化合物数量有限，有待更多的验证。

4.3 在中药胚胎及发育毒性评价中的应用

斑马鱼已广泛应用于环境毒物的监测，近年来也被用于药物毒理包括中药胚胎发育毒性的研究。马钱子碱是消肿止痛中药马钱子的有效成分，也是其毒性成分。张启春等［36］运用斑马鱼模型评估马钱子碱的致畸性和毒性作用。结果表明，马钱子碱在浓度≥100 μmol·L-1时，斑马鱼胚胎孵化率明显降低，其中 200 μmol·L-1可导致鱼卵脊柱侧弯、心包水肿和黑色素少等畸形现象。陈锡强等［37］观察苍耳子水提取物对斑马鱼发育的影响，发现苍耳子水提取物孵育浓度达到7.5 mg·L-1时开始呈现致胚胎死亡的毒性作用；≥11.25 mg·L-1时抑制斑马鱼的孵化，特别是15 mg·L-1时斑马鱼出现心脏积液和翘尾等畸形现象。该研究还发现，苍耳子提取物0.93 mg·L-1明显提高心率，而当＞7.5 mg·L-1时显著降低心率。董永新等［38］将斑马鱼胚胎浸入含不同浓度桔梗总皂苷提取物溶液中养殖，显微镜下观察死亡和畸形。结果表明，高剂量（8 mg·L-1）组致死率和致畸率分别达80%和28%。畸形主要表现为心包水肿、心前区血液淤积、躯干发育停滞和横纹肌结构改变等。

5 结语

中药的开发和利用是中药现代化的重要内容之一，但中药生殖毒性的研究目前处于严重滞后状态，目前绝大多数中药尚未按要求进行全面的生殖毒性研究。然而若将所有中药均按经典的三段式生殖毒性试验进行评价，这将会是一个比较漫长且耗费非常大的工作。若能采用经过验证的体外替代试验预先进行评价，将会给中药生殖毒性的评价带来事半功倍的效果。因此，按GLP要求建立经过验证的生殖毒性替代试验体系是国内的发展趋势，也是快速解决中药生殖毒性评价的新途径。

由于中药的化学成分复杂，体内吸收代谢过程受众多因素干扰，采取体外给药的方式又存在无吸收代谢过程等问题，极大地增加了研究难度。鉴于这种情况，如果在体外替代试验中使用含药血清代替中药粗提物，则能比较接近地反映药物在体内的状态，发挥药效的活性成分基本与体内保持一致［22］。但为确保含药血清的质量，在制备含药血清时应使用合适的方法对血清相关成分进行测定，在可能的情况下将其与其他毒性试验中毒代动力学试验数据和（或）药动学数据进行对比，以确保用于替代试验的含药血清的质量符合要求。

浙江中医药大学团队应用已知胚胎毒性的10种中药评价EST、MM试验和WEC试验在中药胚胎毒性预测的准确性和灵敏度时提出，应用多个替代模型而非单个替代测试能更准确预测受试中药的毒性［39］，这也提示选择体外替代试验时需考虑并区分胚胎毒性和致畸性，正确选择组合策略［40］。而在不能获取同类或者相似成分药物的安全性资料的情况下，可考虑根据需要逐步增加模型复杂性的测试策略［41］。例如，第一阶段使用短周期细胞试验检测药物对早期分化阶段的影响；第二阶段用长周期细胞胚胎毒性试验检测药物对晚期分化阶段的影响；第三阶段使用胚胎试验，根据胚胎的分子和形态变化检测药物胚胎毒性。

生殖毒性评价是涉及亲代两性、多阶段的复杂问题，体外替代试验因预测模型相对简单，也存在体内外代谢差异等一定的局限性，但体外替代试验具有便捷高效的优势。近年来随着各种新技术的出现以及人们对试验节点拆分组合的思考，体外替代试验在实践中也有了新的改进和发展，也将会越来越多地用于药物筛选、补充试验和机制研究。