狂犬病mRNA疫苗的应用和研究进展

石磊泰,李玉华

狂犬病病毒是弹状病毒家族的单链RNA病毒,可以感染多种哺乳动物,大约95%的人类感染是由狗咬伤引起的,其他宿主包括土狼、臭鼬和蝙蝠等[1]。由于病例报告不足和缺乏可靠的监测数据,狂犬病的真正感染状况难以量化[2],但据目前估计,有超过30亿人处于较高感染风险,每年有约60 000人患病死亡,大约每10 min就有1人死亡[3]。

庆幸的是,路易斯·巴斯德(Louis Pasteur)早在1885年就发明了狂犬病疫苗[4-5]。尽管长期以来一直存在有效的狂犬病疫苗,但在一些发展中国家疫苗的可用性仍然不足,致命的感染数量很高。

令人振奋的是,基于核酸的疫苗技术已被证明是用于快速开发针对新兴病原体、无疫苗疾病或用于替代现有疫苗的新技术。目前文献最早关于m RNA疫苗的报道发表于1990年,当时Wolff将报告基因mRNA注射到小鼠体内后检测到相关蛋白质的产生[6]。1992年的一项后续研究表明,在大鼠下丘脑注射编码加压素的m RNA可以引起生理反应[7]。

与亚单位疫苗、灭活疫苗、减毒活疫苗以及DNA疫苗相比,m RNA疫苗有其独特的优势[8-12]。安全性方面:m RNA是一个非感染性、非整合性平台,不存在感染或插入突变的潜在风险。m RNA可被正常的细胞代谢降解,其半衰期可以通过各种修饰和传递方法来调节。mRNA的固有免疫原性可被下调以进一步提高安全性。有效性方面:多种修饰使m RNA更稳定,更易翻译。有效的体内传递可以通过将m RNA形成载体分子来实现,允许其在细胞质中被快速摄取和表达。规模化生产:由于体外转录反应的高产量,m RNA疫苗具有快速、低成本和大规模生产的潜力。

目前各类m RNA疫苗在基础研究和临床研究方面都出现了突破性进展,本文仅对m RNA疫苗在狂犬病方面的应用和研究做一综述。

1 mRNA疫苗的结构

目前应用于狂犬病m RNA疫苗的研究策略主要有两种,一种是非复制型mRNA疫苗(non-replicating m RNA),另一种是自扩增型m RNA疫苗(self-amplifying mRNA,SAM)。

1.1 非复制型m RNA 非复制m RNA的组成包括:5′帽子、3′poly A尾、非翻译区(UTR)和编码序列。

5′帽子结构是在体外转录过程中加入核苷酸的5′端。最常见的帽子结构是7-甲基鸟苷三磷酸(m7G)cap(cap0),它能阻止m RNA的早期降解,在m RNA的成熟、转运和初始翻译过程中起着关键作用[13]。但加帽会出现序列方向反转,导致没有形成帽子结构而无法正常转录[14]。为避免这类错误发生,在帽子结构鸟苷的3′-O位上进行甲基化,使其只有一个3′-OH可以添加核苷酸,形成防反帽子结构,从而大幅提高m RNA的表达[15]。

3′Poly A尾通过与多聚腺苷酸结合蛋白、起始转录因子和5′帽子形成复合物来发挥作用[16]。研究表明增加Poly A尾的长度提高蛋白表达效率[17],但Poly A的最佳长度为100～150个核苷酸[18-19]。

非翻译区UTR是影响mRNA转运与翻译效率、细胞器定位和稳定m RNA结构的重要元件。目前被广泛应用的UTR为α-和β-球蛋白基因序列,它们能够大幅提高RNA的转录效率和稳定性[20-23]。此外,人热休克蛋白70、烟草蚀纹病毒、内部核糖体进入位点等序列也被应用于UTR以提高转录效率[24-26]。

有文献报道,提高序列中C、G的比例、对碱基进行编辑优化,可以提高mRNA稳定性[27]。对m RNA的核苷酸进行甲基胞嘧啶、假尿嘧啶、硫代尿嘧啶等化学修饰可以降低固有免疫反应[28-29]避免m RNA疫苗遭到固有免疫清除而影响免疫效果。但也有研究表明,碱基和核苷酸的改变可能导致m RNA二级结构改变,可能会影响蛋白正确折叠和T细胞表位暴露,反而降低了免疫效果[30-32]。

1.2 自扩增型m RNA疫苗 自扩增型的m RNA比非扩增型mRNA要大得多(9～10 kb),但也含有m RNA的基本成分(一个帽子,5′UTR,3′UTR和可变长度的poly A尾)[33]。自扩增型m RNA包含5′帽子、非结构基因(nsP1-4)、26S亚基因组启动子、疫苗抗原基因、3′非翻译区(UTR)和poly A尾。研究最深入的自扩增型mRNA来自甲病毒基因组,例如辛德比斯、塞姆利基森林和委内瑞拉马脑炎病毒。在以甲病毒为基础的自扩增型m RNA中,额外的RNA包含一个大的开放读码框(ORF)、四个非结构蛋白编码区(nsP1-4)和一个亚基因组启动子。病毒基因组中编码病毒结构蛋白的基因被目的基因所取代,从而使得mRNA不能产生感染性病毒。释放的m RNA进入细胞浆后具有翻译活性,与宿主细胞核糖体结合产生RNA依赖性RNA聚合酶(RDRP)或病毒基因组复制的4种功能成分:nsP1、nsP2、nsP3和nsP4。翻译后的nsPs在细胞膜表面形成复制工厂,从输入m RNA转录全长负链拷贝。该负链拷贝作为两个正链RNA分子的模板:基因组m RNA和较短的共线亚基因组m RNA。该亚基因组mRNA(也称为26S RNA)以极高的水平转录,从而可以扩增编码疫苗抗原的m RNA。

2 递送系统

外源mRNA必须穿过脂膜屏障才能到达细胞质转化为功能蛋白,迄今为止有两大类m RNA疫苗的递送方法[34]。第一大类,体外将mRNA导入树突状细胞(DC),然后再输注转染细胞;第二大类,直接注射有或没有载体的mRNA。第1种可以精确控制细胞靶点、转染效率和其他细胞条件,主要用于细胞治疗。第2种直接注射mRNA方法虽然还不能实现精确和有效的细胞类型特异性传递,但是一种相对快速和经济有效的方法。以下介绍mRNA疫苗的几种递送系统。

2.1 树突状细胞(DC) 树突状细胞是免疫系统中最有效的抗原呈递细胞。它们通过内化和蛋白质水解处理抗原并将其呈递给主要组织相容性复合体(MHC)上的CD8＋和CD4＋T细胞(即MHCⅠ类和MHCⅡ类)启动适应性免疫应答。此外,树突状细胞可将完整抗原呈递给B细胞以激发抗体反应[35]。树突状细胞很容易接受mRNA转染,因此树突状细胞是m RNA疫苗在体内和体外转染非常有效的途径。这种m RNA传递方法因其不需要载体分子就能产生高转染效率而受到青睐[36]。

2.2 裸m RNA 裸m RNA已成功应用于体内免疫,特别是优先靶向抗原提呈细胞的形式,如皮内注射、鼻内注射[37]。值得注意的是,最近的一份报告显示,用编码肿瘤相关新抗原的未修饰的m RNA重复在鼻内免疫可产生强大的T细胞应答,并增加半衰期[38]。

2.3 鱼精蛋白 阳离子肽鱼精蛋白可以保护m RNA不被血清RNA酶降解[39],起到免疫激活剂的作用[40],然而鱼精蛋白和m RNA过度紧密结合可能影响m RNA的表达[41]。

2.4 阳离子脂质 脂质纳米颗粒(LNPs)早期应用于小干扰RNA(siRNA)领域[42],直到最近才发现LNPs是体内传递非复制m RNA[43]和自扩增型m RNA的有效工具[44],目前已成为最具吸引力和最常用的信使RNA传递工具之一。LNPs通常由4个部分组成:一种可电离的阳离子脂质,可促进自组装成病毒大小的颗粒,并允许向细胞质释放m RNA;脂联聚乙二醇(PEG),可以延长制剂的半衰期;胆固醇,起稳定制剂作用;磷脂,维持脂质双层结构。

2.5 阳离子纳米乳剂(CNE) 阳离子纳米乳剂(CNE)递送系统,用于递送自扩增型m RNA疫苗。这种递送系统基于诺华公司专有的佐剂MF59添加了阳离子脂类(2-二油酰基羟丙基-3-N,N,N-三甲铵氯,DOTAP)制成。有研究表明,在小鼠、大鼠、兔子和非人类灵长类动物中,CNE递送一个9 kb大的自扩增型m RNA可引发强大的免疫应答[45]。

3 非复制型mRNA疫苗的应用研究

3.1 临床前研究 Schnee等[46]2016年使用优化的非复制型狂犬病毒糖蛋白RABV-G(巴斯德株,GenBank登录号:AAA47218.1)编码的mRNA疫苗用小鼠和家猪测试免疫反应,他们将构建的RABV-G m RNA疫苗命名为CV7201。CV7201是利用巴斯德狂犬病毒株的糖蛋白基于RNA技术平台所构建,用脂质纳米粒包裹后加鱼精蛋白作为稳定剂制成。雌性C57BL/6和BALB/c小鼠在第0 d和第21 d皮内注射接种CV7201疫苗,注射剂量为1.25μg到80μg。第2次 免 疫 后2周,100%的C57BL/6小鼠和90%(29/32)的BALB/c小鼠注射了≥10μg CV7201疫苗,均产生≥0.5 IU/m L的病毒中和抗体滴度[47]。在这两种品系的小鼠中均观察到剂量-反应关系,并且在剂量≥10μg时诱导产生高中和抗体滴度。在免疫耐久性方面,BALB/c小鼠在第0 d和第21 d接种两次疫苗,观察4个不同剂量1.25μg、5μg、20μg、80μg CV7201疫苗免疫小鼠1年左右,每月检测小鼠血清抗体,所有用CV7201疫苗免疫的小鼠都产生了高滴度的中和抗体。研究发现接种20μg和80μg CV7201后,抗体滴度在整个观察期内保持稳定,平均滴度在17和65 IU/m L之间。对于1.25μg和5μg疫苗剂量,免疫反应在观察期刚开始出现延迟,但在实验第12周赶上,抗体滴度保持在≥10 IU/m L的高水平,所有试验组的个体间变异性较低。

虽然T细胞不能阻止宿主细胞的初始病毒感染,但它们对小鼠体内狂犬病病毒的清除有重要影响[48]。Schnee M同时也开展了针对CV7201细胞免疫方面的研究,结果显示:在第2次接种80μg CV7201或0.1人剂量Rabipur后6 d,在所有接种小鼠中检测到抗原特异性干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)CD8

＋和CD4＋T细胞出现增高的现象。接种Rabipur或CV7201疫苗的小鼠RABV-G特异性CD8＋T细胞的增高具有可比性(例 如IFN-γ/TNF-α双 阳 性CD8＋T细胞,接种CV7201后平均值为0.59%,接种Rabipur后平均为0.43%)。相反,与高比例IFN-γ/TNF-α双阳性CD4＋T细胞的Rabipur免疫小鼠相比,m RNA免疫小鼠的抗原特异性CD4＋T细胞显著升高(RABV-G m RNA免疫小鼠表达IFN-γ/TNF-α的CD4＋T细胞的平均值为0.48%,而Rabipur的平均值为0.091%)。

用狂犬病毒对实验动物进行脑内病毒攻击虽然是一个人为的、极其严峻的挑战,但被科学界认为是一个严格的、有说服力的测试实验。Schnee M利用NIH法[49]对BALB/c小鼠在第0 d和第21 d接种80μg CV7201。阳性对照小鼠肌肉接种0.1人剂量的二倍体狂犬病疫苗,阴性对照小鼠接种注射缓冲液(乳酸林格溶液)。第2次注射6周后,用40个LD50的CVS-11进行脑内攻毒,结果显示:所有CV7201和二倍体狂犬病疫苗免疫小鼠均能抵抗狂犬病毒的攻击。这项攻击性研究清楚地表明CV7201疫苗能诱导对致命感染的保护性免疫。

Schnee M进一步评价了CV7201疫苗在家猪体内的免疫原性。在成年猪中,抗体水平在第一次免疫后达到≥0.5 IU/m L的保护水平,并且可以通过加强免疫进一步增加,抗体水平在整个试验期间保持稳定。有趣的是,第三次疫苗接种并没有导致抗体水平进一步增加。另外,针对新生猪仔的免疫研究也显示加强免疫可以使猪仔体内抗体水平进一步提高。

Schnee M的这项研究证明了非复制性m RNA狂犬病疫苗在小型和大型动物中的可行性,并展示了m RNA疫苗在预防传染病方面的前景。

3.2 临床研究 基于编码抗原的m RNA的疫苗在临床前模型中被证明了其安全性和有效性[46]。Alberer M等[50]2017年报告了狂犬病m RNA疫苗CV7201在健康人体的研究结果,这是世界上第一次把狂犬病m RNA疫苗应用于人体临床研究的报道(临床批件为NCT02241135)。

2013年10月21日至2016年1月11日,在德国慕尼黑开展了这项开放性、非对照、前瞻性的1期临床试验,入围人群是101名无狂犬病疫苗接种史的健康男性和女性志愿者(年龄18～40岁)。志愿者分皮下和肌肉注射两种免疫途径分别接种3剂CV7201,接种装置为带针头注射器和三种无针注射器(弹簧式皮内注射器、二氧化碳气动皮内注射器和弹簧式肌肉注射器)。带针注射器肌肉免疫组共4个队列,每队列6人,免疫剂量分别为80、160、320和640μg,免疫程序均为0、28和56 d;弹簧式肌肉注射器肌肉免疫组共2个队列,7人队列接种200 μg,6人队列接种400μg,免疫程序均为0、28和56 d。带针注射器皮下免疫组共3个队列,2个6人队列分别接种80、160μg,免疫程序均为0、7和28 d,第3个6人队列接种320μg,免疫程序为0、28和56 d;弹簧式皮内注射器皮下免疫组共3个队列,两个6人队列分别接种80、160μg,免疫程序为0、28和56 d,第3个6人队列接种80μg,免疫程序为0、7和28 d。二氧化碳气动皮内注射器皮下免疫组共2个队列,6人队列接种80μg,7人队列接种160 μg,免疫程序均为0、7和28 d。对随后的队列给予递增剂量,其中一个队列在1年后接受增强剂量。

这项研究的主要终点是安全性和耐受性,次要终点是确定CV7201的最低剂量以诱导狂犬病病毒中和抗体水平等于或大于WHO规定的保护性抗体水平0.5 IU/m L。在接种后的7 d内,64名皮内接种受试者中有60名(94%)和37名肌肉接种受试者中有36名(97%)报告了注射部位不良反应,64名皮内接种受试者中有50名(78%)和37名肌肉接种受试者中有29名(78%)报告了全身不良事件。有3个严重不良事件,其中一个被研究者评估为可能与研究疫苗接种有关。报告1例暂时性中度(2级)贝尔麻痹,在第二次注射640μg CV7201后7 d,出现疑似意外的严重不良反应。

不考虑免疫剂量和免疫程序的情况下,使用无针注射装置接种m RNA疫苗,皮内注射80μg或160μg CV7201剂 量 的45名 受 试 者 中 有32名(71%)以及肌肉注射200μg或400μg CV7201剂量的13名受试者中有6名(46%)受试者的病毒中和抗体滴度在0.5 IU/m L或以上。相反,用带针注射器进行皮内或肌肉免疫效果不佳,只有2名志愿者(皮内注射320μg)显示出可检测的免疫反应。

这项首次在健康人群开展的临床研究结果表明,一种预防性m RNA候选狂犬病疫苗尽管在使用带针注射器免疫时不能产生有效的免疫反应,但在使用无针装置免疫时却可以诱导产生针对病毒抗原的功能性抗体。疫苗总体上是安全的,也具有合理的耐受性,但是不良反应也不容忽视[51]。

4 自扩增型mRNA疫苗的应用研究

Alan Stokes等[52]2020年报道了一种新型狂犬病自扩增型m RNA疫苗(RG SAM)在大鼠身上重复给药及生物分布的非临床安全性评价性研究。该技术平台由编码RNA依赖性RNA聚合酶的工程复制缺陷型甲病毒基因组和目标抗原基因组成。该研究采用狂犬病毒糖蛋白G作为目标抗原并选择阳离子纳米乳剂(CNE)作为递送系统。为了描述这种疫苗的局部耐受性、潜在的全身毒性和生物分布,研究人员开展了两项非临床研究。

在重复剂量毒性研究中,对大鼠进行肌肉注射RG SAM疫苗,每两周注射一次,共4次,留四周的恢复期。大鼠免疫RG SAM疫苗后的相关变化包括中性粒细胞、α-2巨球蛋白和纤维蛋白原水平的短暂增加,雌性大鼠体内出现天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶一过性的升高。活体解剖时可以观察到局部淋巴结有炎症浸润,但在恢复期炎症自行消失,淋巴结也恢复正常。

在生物分布研究中,大鼠单次肌肉注射RG SAM疫苗后观察60 d。第2 d在注射部位和淋巴结中发现狂犬病毒RNA,随着观察期延长这些组织中的狂犬病毒RNA分布逐渐减少,到第60 d时仍然可以检测到。狂犬病毒RNA也会在大鼠的血液、肺、脾和肝中短暂出现,但在大鼠的脑和脊髓中没有观察到微观的病理变化。

Alan Stokes的这项研究对狂犬病自扩增型m RNA疫苗进行了初步探索,虽然未对疫苗的安全性和有效性展开深入探讨,但也为后续自扩增型m RNA疫苗技术的完善提供了实验数据。

5 结 语

m RNA疫苗的兴起已成为传统疫苗最有希望的替代方法,m RNA疫苗因其适宜大规模生产和低成本等优点备受科学界青睐,并且在癌症治疗和疾病预防方面取得阶段性进展。虽然狂犬病m RNA疫苗也有进入临床试验的报道,但试验结果并不尽如人意。研究者还需从根本上解决注射狂犬病m RNA疫苗后引起的严重不良反应,如面瘫。解决这一问题也许需要从RNA构建平台入手,也许需从递送系统考虑。狂犬病是致死性疾病,不能在所有接种者中实现足够安全和有效的狂犬病疫苗是不可接受的。

近期,国内有研发机构发明了以狂犬病毒CTN-1株糖蛋白为模板构建的m RNA人用狂犬病疫苗[53],但目前尚未看到后续的进展报道。希望国内的疫苗企业在狂犬病m RNA疫苗研发方面也能取得突破性进展。

利益冲突:无

引用本文格式:石磊泰,李玉华.狂犬病m RNA疫苗的应用和研究进展[J].中国人兽共患病学报,2021,37(12):1123-1128.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.158