SARS-CoV-2的宿主组织分布和体液中排放研究进展

张拥军,凌 华,陈爱平

作为第7种能够感染人类的冠状病毒,SARSCo V-2引起的2019年冠状病毒病(COVID-19)全球大流行已经持续了1年多时间。这场前所未有的疫情传播速度快,波及范围广,给全球经济、社会带来巨大的影响,迄今已经有确认超过1.1亿人感染,超过252万人丧生[1]。尽管采取了各种非药物干预的公共卫生措施,并且已经有多个疫苗紧急获得批准,在数十个国家先后开展大规模预防接种,目前新增感染人数仍然高居不下,全球疫情防控形势十分严峻。

在过去的一年多里,随着疫情规模的不断扩大,经过全球各相关领域的科学家共同努力,不同学科对于这个全新疾病的认识不断在积累更新。虽然SARS-Co V-2与严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-Co V)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERSCo V)同属于冠状病毒科(Coronaviridae)β冠状病毒属(Betacoronavirus),其基因组结构存在较大的差异,与SARS-Co V、MERS-Co V基因组的相似度分别约为80%、50%[2]。这3种病毒都能够引起严重呼吸系统疾病,其动物宿主、流行病学、临床表现等方面已经证实存在差异[3]。本文从病原学角度,通过总结SARS-Co V-2的细胞受体在人体不同组织的分布和被感染患者不同器官的临床症状,根据国内外COVID-19尸检报告分析病毒的人体细胞嗜性,并根据各种体液样品的检测结果描述病毒在不同体液中持续排放特征。以促进深入理解SARSCo V-2致病机制,推动感染防控措施,加强感染者管理和治疗,促进科学防控COVID-19全球大流行疫情。

1 SARS-CoV-2病毒受体在人体组织中的分布

不同的病毒感染各种宿主细胞都需要特定的病毒受体,这类受体在不同细胞表面的表达和分布决定了病毒的组织嗜性。在确认了SARS-Co V-2是导致COVID-19的病原之后,研究人员随即证实血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)和跨膜丝氨酸蛋白酶2(Transmembrane Serine Protease 2,TMPRSS2)参与了SARS-Co V-2感染过程[4-6]。其中,ACE2作为病毒进入细胞的表面受体,TMPRSS2则裂解和激活病毒刺突蛋白S。因此,明确ACE2受体和TMPRSS2在人体组织中的分布、表达和活性有助于理解SARS-Co V-2潜在感染人体的途径和致病机制。

经过不同团队证明,ACE2受体在以下组织表达,包括呼吸道上皮(气管和支气管上皮细胞、2型肺泡细胞)、心血管系统(冠状动脉内皮细胞、心肌细胞、心外膜脂肪细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞)、胃肠道(食管角质细胞、胃肠道上皮细胞、肠上皮细胞、十二指肠、小肠、直肠)、泌尿生殖系统(近端肾小管、膀胱尿道上皮细胞、睾丸、精囊)以及肝脏、胆囊和神经系统。但脾、甲状腺、淋巴结、骨髓和部分免疫系统细胞无ACE2受体[4-6]。

根据人类蛋白图谱(Human Protein Atlas,HPA)数据库中RNA和蛋白表达数据,TMPRSS2主要在肺、唾液腺、甲状腺、胃肠道、胰腺、肾、肝细胞中表达。在多种男性组织如输精管、储精囊、前列腺中,TMPRSS2也有较低水平表达,但在睾丸细胞及所有女性组织(乳房、卵巢、输卵管、子宫、胎盘)中无TMPRSS2表达,TMPRSS2的组织分布可能与SARS-Co V-2在男性的高感染率和严重程度中发挥作用[4-6]。

值得注意的是,目前有研究表明,ACE2在人体多种组织存在不同水平的表达,而且在口腔、胃肠道和男性生殖系统表达最高,但该受体表达水平并不与病毒检测结果相对应,表明SARS-Co V-2的致病机制还涉及到病毒与宿主的复杂相互作用[4-6]。

2 COVID-19患者不同器官/系统的临床表现

COVID-19的主要传播途径是呼吸道飞沫和密切接触传播,接触病毒污染的物品也可造成感染,传染源主要是SARS-Co V-2感染的患者和无症状感染者[7]。越来越多证据显示SARS-Co V-2并不局限于呼吸道,还能够扩散到其它多种器官,这些器官组织中也存在ACE2受体不同程度的表达。因此,大多数COVID-19患者除了呼吸道症状,还存在神经系统、心血管、胃肠道、肾的功能失调。SARSCo V-2感染可能引起呼吸系统的症状包括发烧、干咳、喉咙痛、多痰、身体不适、呼吸困难,严重的发展为呼吸衰竭[7-10]。病毒感染导致胃肠道可能出现厌食、腹泻、恶心、呕吐和腹痛等症状。常见的中枢神经系统症状是眩晕和头痛,常见的周围神经系统症状是味觉和嗅觉减退或丧失。队列研究观察到部分患者出现急性肾损伤、心肌受损和心脏衰竭,而部分患者出现丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)升高,表明病毒感染还可能殃及肝组织。同时,有报道显示,近20%COVID-19患者出现皮肤异常,包括荨麻疹、空泡、紫癜及丘疹样鳞状病变[7-10]。

3 SARS-CoV-2病毒成分在人体不同组织中的分布

为了探索SARS-Co V-2的传染性和导致包括呼吸道在内的多器官衰竭机制的生物学基础,利用尸检组织观察COVID-19相关的病理学和形态学变化、确认病毒成分在不同组织中出现,能够获得病毒感染引起组织、器官损伤的直接证据[4,11-15]。目前常用于证明人体组织存在病毒成分的方法包括病毒核酸检测、电镜、免疫组织化学。通过原位杂交或核酸扩增可以检测病毒RNA在患者组织中的存在;透射电镜技术由于能够直观观察到病毒颗粒,适合调查COVID-19患者组织中病毒分布;利用针对病毒蛋白(S蛋白、N蛋白等)的特异性抗体进行免疫组织化学分析检测患者组织中相应的病毒抗原,同样能够准确定位病毒成分在组织中的分布[4,12]。值得注意的是,直接通过透射电镜观察,仅仅根据形态学特征容易错误地将一些亚细胞结构判定为病毒颗粒。先前有文献报道利用透射电镜在各种尸检样品中观察到SARS-Co V-2病毒颗粒,部分结果随后却受到质疑。因此,在透射电镜的基础上,需要结合其它技术如PCR、免疫组化、原位杂交、免疫电镜技术等,才能确认透射电镜观察到的结果[12,15]。

Dorward等[13]对英国11例死亡患者尸检,采集了37份不同解剖部位的样品(来自上呼吸道、下呼吸道、心、胃肠道、肾、肌肉等器官),通过多重PCR、测序和原位免疫组化检测病毒S蛋白的方式确定病毒在不同组织分布。所有器官和组织采样点都检测到SARS-Co V-2 RNA,呼吸道最常见,其它部位如胃肠道、心、肌肉也有检出,从肝、肾及其它器官较少检出,患者之间不同组织部位的病毒分布也存在差异。病毒S蛋白主要出现在呼吸道、胃肠道、肝、肾的上皮细胞,部分肺巨噬细胞(CD68＋细胞)、内皮细胞(CD105＋细胞)也检测到S蛋白,与病毒进入细胞受体ACE2表达的分布一致,在PCR检测SARS-Co V-2阴性组织中较少检出,未感染SARSCo V-2的患者尸检组织没有检出S蛋白。

Schurink等[14]对荷兰一家医院21名COVID-19死亡患者进行了前瞻性尸检队列研究,免疫组化发现多个器官存在SARS-Co V-2感染细胞。肺里病毒抗原最丰富,包括1型和2型肺泡细胞、内皮细胞、支气管上皮、肺泡巨噬细胞等,其它器官包括上呼吸道、心、肾、胃肠道也检测到病毒抗原。根据Trypsteen等对多项类似研究的总结,证明多种器官存在SARS-Co V-2病毒成分(病毒RNA、病毒蛋白),包括咽、气管、肺、血液、心、血管、肠、脑、男性生殖器、肾,其中上呼吸道、肺、口腔、胃肠道和泌尿系统表达最高[4]。以上结果说明,SARS-Co V-2具有广泛的组织嗜性,能够在多种器官中检出。

4 病毒在不同体液中分布及持续排放

既然多种宿主组织细胞存在受体ACE2表达,也在COVID-19患者不同组织器官中检测到SARS-Co V-2病毒成分,完整的有感染性的病毒颗粒和成分也可以进入不同体液中,病毒还可能通过多种体液排出,并增加了病毒传播给新宿主的机会,进而成为潜在的传染源。因此,明确SARS-Co V-2在不同体液中病毒载量的动力学以及病毒排放持续时间,有助于全面认识病毒传播和致病机制、妥善管理密切接触者和患者、科学部署各种非药物干预措施[16-22]。人体的体液包括血液、脑脊液、尿液、唾液、痰、眼泪、精液、乳汁、羊水和阴道分泌物等,病毒还可能通过粪便排放。COVID-19全球大流行疫情暴发以来,除了将常见的上呼吸道样品(咽拭子、鼻拭子、喉拭子、鼻咽抽吸物等)和下呼吸道样品(肺泡灌洗液、下呼吸道抽吸物等)作为病毒核酸检测的主要样品来源之外,国内外机构也尝试过检测不同体液样品,探索病毒在不同体液的分布、病毒载量以及持续排放时间,采用的方法包括核酸检测、病毒分离培养以及病毒抗原检测[16-21]。核酸检测阳性率最高的是肺泡灌洗液,其次为痰、鼻拭子、咽拭子、粪便、全血、尿[7]。

Wang等[18]在疫情早期就报道了我国205名患者1 070份样品(咽拭子、鼻拭子、血液、痰、粪便、尿液等)的检测,发现肺泡灌洗液阳性率最高,其次为痰、鼻拭子、纤维支气管镜活检、咽拭子、粪便,血液样品检出率仅1%,72份尿液未检测到病毒RNA。在各种样品中,鼻拭子平均病毒载量较高(1.4×106copies/m L),其余样品的平均病毒载量较低(＜2.6×104copies/m L)。同时报道从患者粪便样品中分离到活病毒,表明病毒可能通过粪便途径传播,为疫情早期开展感染者筛查、患者管理提供了重要信息。

Wölfel等[19]对9例德国COVID-19患者不同样品(口咽拭子、鼻咽拭子、痰、粪便、尿液、血液)进行了连续动态监测,发现咽部的病毒排放在出现症状第1周最高,第4 d口咽拭子病毒载量最高达到7.11×108copies/m L,随后拭子样品病毒载量下降迅速。出现症状后持续观察到病毒排放,最长28 d仍然可能从拭子样品检测到病毒RNA。痰液的平均病毒载量为7.00×106copies/m L,下降速度稍慢。仅能从口咽或肺相关样品中分离到有感染性病毒,粪便样品尽管检测到病毒RNA浓度较高,但未能分离到病毒。多数患者粪便中出现病毒RNA的持续时间与痰液一致,而27份尿液和31份血液均未检测到病毒RNA。

Chen等[20]对深圳第三人民医院145例COVID-19患者资料的分析显示,入院时平均病毒载量为1.16×104copies/m L,其中,支气管肺泡灌洗液最高,平均为5.7×104copies/m L,呼吸道样品平均为4.9×103copies/m L,鼻咽拭子平均为1.32×104copies/m L,痰液样品平均为2.9×102copies/m L,血液平均为4.2×103copies/m L。平均病毒排放时间为17.3 d,其中普通住院患者平均为12.1 d,进入危重病房的患者平均为24.4 d。核酸阳性、实时荧光PCR检测Ct值较低的患者其病毒排放时间更长。以上结果,通过大量病例相关数据,总结了COVID-19患者病毒分布及变化规律。

Li等[21]采用数字PCR对37例患者185份样品(鼻咽拭子、肛拭子、唾液、血液、尿液)进行检测,样品来自病程7～69 d。检测阳性率分别为鼻咽拭子(54.05%)、肛拭子(24.32%)、唾液(16.22%)、血液(10.81%)、尿液(5.41%)。有的患者鼻咽拭子阴性,但其它样品阳性。平均病毒载量(copies/test)分别为鼻咽拭子(16 224±67 507)、肛拭子(20±26)、唾液(5 677±13 647)、血液(16±9)、尿液(5.1±0),再次证明鼻咽拭子和唾液具有较高病毒载量,同时也准确地描述了不同体液中病毒载量。

根据Cevik等[22]对79项COVID-19研究的总结,SARS-Co V-2 RNA在上呼吸道平均排放时间为17.0 d,下呼吸道为14.6 d,粪便为17.2 d,血液16.6 d。报道的最长病毒排放时间为上呼吸道83 d,下呼吸道59 d,粪便126 d,血液60 d。另外,虽然偶尔有报道在个别案例中从脑脊液、乳汁、眼泪等样品中检出病毒RNA,这类体液样品的总体检出率极低[4]。

5 小结与展望

通过一年多来对COVID-19患者的持续观察,已经证明SARS-Co V-2能够感染人体多种器官,并且能够从多种体液中检测到病毒相关成分。虽然目前已经在病毒引起的呼吸系统病变取得一些共识,病毒在人体其它组织引起的病变及其机制尚未完全明确。因此,继续监测分析病毒在不同组织的分布以及病毒从不同体液的排放时间,有利于全面认识病毒的致病机制,监测疾病变化和进程,研判疾病预后结果。随着疫情形势的发展,可以预见,在疫情完全终止之前的相当长一段时期内,对于病毒相关成分的监测仍然是必需的。在分析和利用这些检测结果时,需要注意以下方面:1)谨慎解读SARS-Co V-2病毒相关成分(病毒颗粒、病毒抗原、病毒RNA)在组织中检出结果。一方面,透射电镜观察病毒颗粒一定要具备病理学、病毒学、形态学等多个学科的知识和经验,并熟悉病毒形态、形态发生和正常亚细胞结构等领域,才能得出可靠的无争议的结论;另一方面,在特定组织细胞中检测到病毒抗原和病毒RNA不一定代表完整的有感染性的病毒,可能是过量表达的病毒抗原或病毒亚基因组,因此相关病理学改变不一定是病毒感染的直接病理损伤,出现阳性结果可能是因为这些病毒成分随着体液循环被转运到相应器官。2)提高检测灵敏度,使检测结论更加可靠。目前普遍采用实时荧光RT-PCR检测病毒RNA,文献中不同团队报道的结果(如脑脊液、眼泪、乳汁等)存在冲突。主要原因在于一些实时荧光RT-PCR检测体系敏感性不足,影响低病毒载量样品的检出率,这类样品需要灵敏度更高的数字PCR平台。因此急需在数字PCR平台上,全面准确描述SARS-Co V-2在不同组织和体液中分布,深入认识致病机制,促进提高COVID-19诊断治疗水平。3)合理选择检测样品种类。如前所述,病毒在不同体液样品中出现和持续排放的时间有差异,在临床实践过程中,应当根据已知的SARS-Co V-2在不同体液动态变化规律,调整检测策略特别是样品类型,在不同病程时间点采集合适的样品进行分析,使临床诊断更加精准,从而更加科学地开展感染者管理(出院、隔离和解除隔离)。4)正确认识病毒相关成分检测结果与患者传染性的关系。目前评判样品是否具有传染性的金标准是从患者样品中分离培养得到完整的有感染性病毒颗粒。在感染部位、血液以及其它部位检测到病毒RNA或蛋白,未来大规模人群的COVID-19疫苗接种还可能检测到疫苗相关的病毒成分,所有通过核酸检测到病毒RNA片段或免疫组化检测到特定病毒抗原的结果,都不足以显示样品具有感染性。

综上所述,在全球大流行COVID-19疫情背景下,继续调查总结SARS-Co V-2在人体不同组织的分布和病毒在各种体液中持续排放时间,有利于深入理解SARS-Co V-2致病机制,选择合理的临床诊断检材,评估各种医疗活动的感染风险,推动落实各种感染防控措施,促进感染者管理和治疗以及科学防控COVID-19全球大流行疫情。

利益冲突:无

引用本文格式:张拥军,凌华,陈爱平.SARSCo V-2的宿主组织分布和体液中排放研究进展[J].中国人兽共患病学报,2021,37(12):1118-1122.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.153