血液抗精子抗体与精子表面抗体的相关性*

庞韬,张欣宗,邓顺美,伍嘉宝,周雨,唐雨倩,朱胜辉,钟文谣,蒋敏△

国家卫生健康委员会男性生殖与遗传重点实验室、广东省计划生育科学技术研究所 1男科,2中心实验室,3优生遗传科(广东广州 510600)

雄性生殖细胞包括精母细胞和精子，发育于青春期，在新生期后很长时间内存在，并建立了自我耐受机制。血睾屏障将这些细胞分隔，防止抗体和免疫活性细胞进入曲细精管腔。因此，精子细胞表达免疫系统从来没有遇到过的抗原，并作为自身抗原引发雄性和雌性的免疫反应[1]。对精子的免疫反应是导致不育的原因之一，这一点已经在人类和多种动物身上得到证实[2]。抗精子抗体(AsAb)在血液与精子表面的含量不同，检测方法不一，血液和精液AsAb两者间存在差异，在临床诊断的应用上存在争议。根据《世界卫生组织(WHO)男性不育的标准化检查、诊断和治疗手册》(简称《手册》)，男性免疫性不育的标准化诊断方案主要是检测精子表面存在的AsAb[3]。AsAb分为循环抗体和局部抗体，循环抗体主要存在于血液中，采样和检测较为方便，局部抗体主要存在于精子表面，取样和检测受到一定的限制，血液和精子表面的AsAb检测结果在临床上吻合度欠缺，给临床医师诊断、治疗带来不少困惑。血液和精液AsAb之间是否存在联系，需要我们去研究探索。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2009年6月至2019年4月期间到广东省计划生育专科医院就诊的男性不育患者，排除生殖道等器质性病变，遗传、内分泌障碍、损伤、感染等引起的器质性原因，且染色体正常，无内分泌系统疾病，共3 253例，年龄28～40岁，均为婚后两年以上，性生活正常，未采取任何避孕措施。

1.2 样本

1.2.1 精液 所有患者在标本采集前均禁欲2～7 d，在取精房用手淫的方法收集于干燥洁净的90 mL取精杯内。采集后于37℃水浴箱内孵育至液化后进行检测。共采集1 672例。

1.2.2 血液 按照一般原则进行静脉采血5 mL，使用肝素抗凝管，弃用明显溶血、黄疸血和脂血样品。3 000 r/min离心5 min得到血浆。共采集2 055例。

1.3 仪器与试剂 美国宝特BIO-TEK Elx-800酶标仪、德国IBL公司抗精子抗体酶联免疫定量试剂盒(RE52001)、深圳华康生物医学有限公司精子膜表面抗体IgG检测试剂盒。

1.4 研究方法

1.4.1 精子表面AsAb检测[混合抗球蛋白反应试验(mixed antiglobulin reaction test,MAR试验)] 应用MAR试剂盒，按照说明书操作。在洁净载玻片上充分混匀新鲜精液标本、致敏微球和抗血清各5 μL，覆盖盖玻片，室温37℃孵育3 min，在400×高倍相差显微镜下观察结果，10 min后再观察1次，计数与致敏微球相互黏附的活动精子百分率(忽略尾尖结合)。每片至少计数200个活动精子。MAR阳性结果用SCMC(精子-宫颈粘液接触试验)和Kremer′s(精子-宫颈黏液穿透实验)验证。超过50%的活动精子包裹在致敏微球上，可判为精子膜表面抗体IgG阳性；如果结合仅限于尾尖，则无临床意义。

1.4.2 血液抗精子抗体定量检测(ELISA试验) 用稀释液将样品分别按1∶51的比例进行稀释，混合均匀。根据所用试剂盒操作说明的步骤要求进行ELISA检测，其中加入TMB底物液100 μL 25℃温育15 min，最后加入终止液100 μL后在酶标仪上测定波长450 nm的OD值，根据标准曲线将OD值转换成样本测定的AsAb浓度值。AsAb浓度>75 U/mL为阳性结果。

1.5 统计学方法 运用SPSS 25.0统计软件进行，对两组标本的抗体阳性检出率进行2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

血液、精液AsAb检测结果:受检患者3 253例，其中血液抗精子抗体检测2 055例，阳性375例，阳性率为18.25%；精子表面AsAb检测1 672例，阳性12例，阳性率为0.718%，两种样品组的阳性检出率差异有统计学意义(P<0.05)。

其中474例患者同时检测精子表面抗体和血液抗体，发现精子表面抗体阳性1例，但该例血液中抗体为阴性，精子抗体阳性率为0.21%；血液中抗体阳性为39例，但精子表面抗体均为阴性；血液抗体阳性率为8.23%，两者差异有统计学意义(P<0.05),表明精子表面抗体与血液抗体的检出率并无相关性。

3 讨论

《手册》指出，免疫因素是男性不育的重要病因，正确的诊断相当重要。AsAb的检测是精子免疫介导不育的主要检查指标。Marconi等[4]指出AsAb产生是由于血-睾丸屏障破坏引起的，9%～12%不育夫妇血液中存在AsAb；1%～2.5%正常生育男性血液发现AsAb。而国内研究尚无精子表面AsAb阳性率的大数据分析结果。本研究通过10年间1672例的男性门诊患者大样本量分析，得出阳性检出率仅为0.718%，与欧洲正常生育男性结果相近。范晶等[5]用MAR检测了288例男性不育症患者精液中的AsAb IgG，阳性率为1.74%，Leushuis 等[6]用MAR检测了1 794对夫妇的丈夫精液中的 AsAb IgG，阳性率约3%。本研究应用ELISA检测男性血液AsAb 2 055例，阳性率18.25%，远高于精子表面AsAb的阳性率。Bohring等[7]发现在60%的健康男性血清中发现了AsAb，其中15%～30%的AsAb与精子结合，与本研究结果相符。

《手册》推荐精子表面AsAb检测采用混合抗球蛋白反应试验或免疫珠试验(immunobead test,IBT)[3]，而ELISA是目前广泛使用的血液AsAb检测方法，不同的方法和标本来源使检测结果受到多方面的影响。精子抗原包括了固有抗原和附着抗原[8]。固有抗原是精子自身产生的，附着抗原是精子进入附睾或与精浆混合后，一些特异蛋白吸附在精子膜上而形成的,此类抗原也可刺激AsAb产生。本研究中，474例患者同时检测精子表面和血液的抗体，精子表面抗体阳性率为0.21%；血液中抗体阳性率为8.23%，血液AsAb阳性率明显高于精子表面，说明血液中出现AsAb并不代表精子表面就有AsAb，两者相关性差。血液AsAb浓度与MAR结果无线性关系,仅有的1例MAR阳性，其患者血液AsAb浓度也是远低于参考值下限,说明血液与精子表面的AsAb没有必然的相关性。

按照WHO男性免疫性不育诊断依据，必须是使用IBT或MAR方法，测定活动精子中黏附免疫珠的精子在50%以上，并用SCMC、Kremer′s或PCT等证实后才能作出免疫性不育诊断。可见检测精子表面的AsAb比检测血液中的AsAb更具有临床价值，血液中出现AsAb并不意味着精子表面就有AsAb黏附。血液中AsAb的效价与精子表面是否存在AsAb的可能性并没有必然联系。许苑等[9]报道60例精索静脉曲张患者AsAb情况，分别用MAR测定活动精子表面AsAb，用ELISA方法测定血清和精浆AsAb，发现精浆和精子表面AsAb测定比血清AsAb测定更具有临床价值，与本研究结果一致。此外，许多研究表明只有当抗体出现在精子表面时才有意义，即便血液中AsAb浓度再高，也不如精子表面抗体阳性对临床对免疫性不育的诊断价值大[10-12]。

但是，近年国内有文献显示不育患者AsAb 阳性率多在 15%～60%，甚至有报道接近90%。笔者认为有几方面的原因：(1)方法学的选择：MAR和IBT作为世界卫生组织(WHO)的推荐方法，已经广泛使用，但还有一些实验室或生殖中心采用其他方法，从而导致阳性率有差异。ELISA检测AsAb具有一定的局限性，仍然存在一些因素制约，仅可作为不孕症的辅助诊断方法使用[13]。(2)参考值的选取不同：不同版本的WHO手册AsAb阳性临界值(MAR)有改变，第2版为10%，第3版为20%，第4版和第5版均为50%，某些MAR试剂盒正常参考值下限仍然采用第2版手册的10%，导致阳性率虚高。(3)结果判读的标准不同：MAR以经典的Coombs试验为理论基础，能够直接检测出新鲜精子表面附着的AsAb，但是该实验结果的判读有一定的主观性，特别是活力较弱精子在成团致敏微球下方颤动与真阳性精子由于阻力作用原地旋转难以区分；此外，不动精子表面出现致敏微球与之黏附也不应计数在内。(4)黏稠度高的精液标本，其精子容易与致敏微球非特异性结合，导致误判为阳性[14]。本研究高黏稠度精液样本均加入含有菠萝蛋白酶的液化剂以降低样本黏稠度，避免出现MAR假阳性。

综上所述，AsAb的检测是临床诊断和治疗不育症的良好指标之一，特别对免疫性不育症的诊断和治疗有重要的应用价值。中国应收集多中心的男性免疫性不育的流行病学资料，严格按照《手册》，以MAR、IBT作为统一的AsAb筛查试验，应用符合要求、质量过硬的试剂盒，做好阴阳性对照质量控制，检测精子表面的AsAb，为男科临床提供准确的实验数据。